Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Le cellule staminali neurali sono definite come una popolazione cellulare multipotente che può auto-rinnovarsi per mantenere una piscina di cellule staminali e differenziarsi in neuroni e glia. Sono i principali tipi di cellule nel sistema nervoso e possono offrire un grande potenziale terapeutico nella medicina rigenerativa attraverso il trapianto di cellule in cervelli malati e feriti^1,2. Come lo sviluppo procede, la popolazione di cellule staminali neurali diventa eterogenea^3,4, e la proporzione di cellule staminali neurali nel cervello diminuisce gradualmente⁵. In generale, le cellule staminali neurali embrionali e altre cellule progenitrici neurali, collettivamente chiamate cellule staminali neurali e progenitrici (NPG), si trovano nelle zone germinali, nella zona ventricolare e nella zona subventricolare nei topi⁶. Nel cervello embrionale, le cellule staminali neurali generano neuroni direttamente o indirettamente attraverso cellule progenitrici intermedie (IPC), e in alcune specie attraverso la zona subventricolare esterna progenitori (oRG)^7,8. La firma molecolare specifica, la morfologia, la posizione nella nicchia delle cellule staminali e il potenziale di differenziazione determinano il ruolo di ciascun sottotipo nell’organogenesi cerebrale e nelle applicazioni cliniche⁹. Tuttavia, i marcatori di superficie cellulare attualmente disponibili non possono inequivocabilmente discriminare e purificare diversi sottotipi di NSPC, limitando la comprensione e l’utilizzo di questi sottotipi.

L’identificazione dei marcatori di superficie primari dei NSPC è limitata da tre ostacoli principali. Il primo è il numero limitato di nSPC nel tessuto, rendendo difficile preparare campioni di proteine della superficie cellulare per l’analisi comune della spettrometria di massa. La seconda limitazione è la difficoltà di produrre sottotipi di cellule pure per la generazione di dati proteici di membrana specifici del sottotipo. Infine, la terza sfida è il basso rapporto delle proteine della superficie cellulare nelle proteine intere cellule, che ostacola la loro sensibilità di rilevamento mediante l’analisi della spettrometria di massa.

Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un approccio chemiopromico per arricchire e identificare selettivamente le proteine della superficie cellulare nelle NSPC primarie etichettando metabolicamente le sialoglycoproteine¹⁰. Per generare un numero sufficiente di NSPC, abbiamo approfittato di un protocollo stabilito per espandere e mantenere gli NSPC embrionali primari in stati indifferenziati in vitro, co-culcolando gli NSPC con linee cellulari endoteliali del cervello del topo utilizzando un supporto permeabile matrice di inserimento (ad esempio, transwell) sistema¹¹. Al contrario, i PNG coltivati da soli senza cellule endoteliali generano progenie differenziata^11,12. Pertanto, i campioni di proteine di questi due sistemi di coltura possono essere analizzati comparativamente per identificare le proteine che sono espresse in modo differenziale negli NPC e nei neuroni differenziati. Poiché la maggior parte delle proteine della superficie cellulare sono modificate dall’acido silico¹³, precursore acido silico innaturale analogico N-azidoacetylmannosamine-tetraacilato (Ac₄ManNAz) è stato utilizzato per dirottare la via metabolica intrinseca in modo che endogeno, di recente i sialoglycan sitolizzati sono etichettati con gruppi di azido, generando una maniglia chimica¹⁴. Attraverso reazioni bioortogonali mediate azido-alkyne, che coniugano biotina ai sialoglycan, le proteine della superficie cellulare possono essere visualizzate e arricchite per l’identificazione proteomica attraverso un fluoroforo o una matrice accoppiata astampata da streptavidino^{o matrice 14}.

Qui, eseguiamo la colorazione dell’analisi del gel SDS-PAGE della superficie sialoglycoproteome da NSPC espansa in una co-coltura endoteliale e differenziando le cellule in un sistema non co-culturale. Purifichiamo anche selettivamente il sialoglycoproteome superficiale nei due sistemi di coltura per il confronto proteomico. Il nostro protocollo, rispetto ai tradizionali protocolli di purificazione della superficie cellulare basati sulla centrismola¹⁵, aumenta l’efficacia dell’estrazione delle proteine superficiali attraverso specifiche coniugazioni e affinità di tag Purificazione. Nel frattempo, aumenta la purezza di estrazione delle proteine della superficie cellulare sulla base della premessa che la verifica avviene principalmente alle proteine della superficie cellulare. Sebbene i fattori endoteliali non possano bloccare completamente la differenziazione degli NSPC espansi, lo studio comparativo tra una co-coltura e una cultura differenziata fornisce un metodo conveniente per individuare le proteine superficiali arricchite con cellule staminali senza la necessità di analizzare le proteine dai PNG purificate dal FACS¹⁶. Riteniamo che questo approccio possa essere applicato agli studi sulle proteine di superficie in altri sistemi con le modifiche appropriate.