Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neuronale Stammzellen sind definiert als eine multipotente Zellpopulation, die sich selbst erneuern kann, um einen Stammzellpool zu erhalten und sich in Neuronen und Glia zu differenzieren. Sie sind die wichtigsten Zelltypen im Nervensystem und können großes therapeutisches Potenzial in der regenerativen Medizin durch Zelltransplantation in kranke und verletzte Gehirne^{bieten 1,2}. Mit der Entwicklung wird die neuronale Stammzellpopulation heterogen^3,4, und der Anteil der neuronalen Stammzellen im Gehirn nimmt allmählich ab⁵. Im Allgemeinen befinden sich embryonale neuronale Stammzellen und andere neuronale Vorläuferzellen, kollektiv als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) bezeichnet, in den Keimzonen, der ventrikulären Zone und der subventrikulären Zone in Mäusen⁶. Im embryonalen Gehirn erzeugen neuronale Stammzellen Neuronen direkt oder indirekt über zwischengeschaltete Vorläuferzellen (IPCs) und bei einigen Arten durch die äußeren subventrikulären Zonenvorläufer (oRGs)^7,8. Die spezifische molekulare Signatur, Morphologie, Lage in der Stammzellnische und Differenzierungspotenzial bestimmen die Rolle jedes Subtyps bei der Hirnorganogenese und klinischen Anwendungen⁹. Die derzeit verfügbaren Zelloberflächenmarker können jedoch verschiedene Subtypen von NSPCs nicht eindeutig unterscheiden und reinigen, was das Verständnis und die Nutzung dieser Subtypen einschränkt.

Die Identifizierung der primären NSPCs-Oberflächenmarker wird durch drei Haupthürden begrenzt. Die erste ist die begrenzte Zellanzahl von NSPCs im Gewebe, was es schwierig macht, Zelloberflächenproteinproben für eine gemeinsame Massenspektrometrieanalyse vorzubereiten. Die zweite Einschränkung ist die Schwierigkeit bei der Herstellung reiner Zellsubtypen zur Erzeugung subtypspezifischer Membranproteindaten. Die dritte Herausforderung schließlich ist das niedrige Verhältnis von Zelloberflächenproteinen in ganzen Zellproteinen, das ihre Nachweisempfindlichkeiten durch Massenspektrometrieanalyse behindert.

Um diese Probleme zu überwinden, entwickelten wir einen chemoprotemischen Ansatz zur selektiven Anreicherung und Identifizierung von Zelloberflächenproteinen in primären NSPCs durch metabolische Kennzeichnung der Sialoglycoproteine¹⁰. Um eine ausreichende Anzahl von NSPCs zu generieren, nutzten wir ein etabliertes Protokoll, um primäre embryonale NSPS in undifferenzierten Zuständen in vitro zu erweitern und zu erhalten, indem wir NSPCs mit Maushirn-Endothelzelllinien mit einer durchlässigen Unterstützung kokultieren. Matrixeinsatz(z.B. Transwell) System¹¹. Im Gegensatz dazu erzeugen NPSCs, die allein ohne Endothelzellen kultiviert werden, eine differenzierte Nachkommenschaft^11,12. So können Proteinproben aus diesen beiden Kultursystemen vergleichsweise analysiert werden, um Proteine zu identifizieren, die differenziell in NSPCs und differenzierten Neuronen exprimiert werden. Da die meisten Zelloberflächenproteine durch Sialinsäure¹³modifiziert werden, wurde der unnatürliche Sialinsäurevorläufer analog N-Azidoacetylmannosamin-Tetraacylatd (Ac₄ManNAz) verwendet, um den intrinsischen Stoffwechselweg zu kapern, so dass endogene, neu synthetisierte Sialoglykane werden mit Azido-Gruppen beschriftet, wodurch ein chemischer Griff¹⁴erzeugt wird. Durch azido-alkyne-vermittelte bioorthogonale Reaktionen, die Biotin zu Sialoglycans konjugieren, können Zelloberflächenproteine visualisiert und zur proteomischen Identifizierung durch ein Streptavidin-gekoppeltes Fluorophor oder Matrix¹⁴angereichert werden.

Hier führen wir die Färbung der SDS-PAGE-Gelanalyse der Oberfläche sialoglycoproteome von NSPCs durch, die in einer endotheliaalen Kokultur erweitert sind und Zellen in einem Nicht-Kokultursystem differenzieren. Wir reinigen auch selektiv Oberflächensialoglycoproteome in den beiden Kultursystemen für den proteomischen Vergleich. Unser Protokoll, verglichen mit den traditionellen zentrifugationsbasierten Zelloberflächenreinigungsprotokollen¹⁵, erhöht die Extraktionswirksamkeit durch Reduzierung der Oberflächenproteinextraktionsverfahren durch spezifische Tag-Konjugation und Affinität reinigung. In der Zwischenzeit erhöht es die Extraktionsreinheit von Zelloberflächenproteinen auf der Grundlage der Prämisse, dass Sialylierung vor allem an den Zelloberflächenproteinen stattfindet. Obwohl endotheliale Faktoren die Differenzierung erweiterter NSPC nicht vollständig blockieren können, bietet die vergleichende Studie zwischen einer Kokultur und einer differenzierten Kultur eine bequeme Methode, um mit Stammzellen angereicherte Oberflächenproteine zu lokalisieren, ohne dass Proteine aus NPCs zu analysieren, die durch FACS¹⁶gereinigt werden. Wir glauben, dass dieser Ansatz auf Studien von Oberflächenproteinen in anderen Systemen mit den entsprechenden Modifikationen angewendet werden kann.