Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Las células madre neuronales se definen como una población celular multipotente que puede renovarse para mantener una piscina de células madre y diferenciarse en neuronas y glia. Son los principales tipos de células en el sistema nervioso y pueden ofrecer un gran potencial terapéutico en medicina regenerativa a través del trasplante celular en cerebros enfermos y lesionados^1,2. A medida que avanza el desarrollo, la población de células madre neurales se vuelve heterogénea^3,4, y la proporción de células madre neurales en el cerebro disminuye gradualmente⁵. En términos generales, las células madre neurales embrionarias y otras células progenitoras neuronales, denominadas colectivamente células madre neurales y progenitoras (SNCCP), se encuentran en las zonas germinales, la zona ventricular y la zona subventricular en ratones^6. En el cerebro embrionario, las células madre neurales generan neuronas directa o indirectamente a través de células progenitoras intermedias (ICD), y en algunas especies a través de los progenitores de la zona subventricular externa (ORGs)^7,8. La firma molecular específica, la morfología, la ubicación en el nicho de células madre y el potencial de diferenciación determinan el papel de cada subtipo en la organogénesis cerebral y las aplicaciones clínicas⁹. Sin embargo, los marcadores de superficie de celda disponibles actualmente no pueden discriminar y purificar inequívocamente diferentes subtipos de SENS, lo que limita la comprensión y utilización de estos subtipos.

La identificación de los marcadores de superficie de los SSPCCP primarios está limitada por tres obstáculos principales. El primero es el número limitado de células de SSPCCP en el tejido, lo que dificulta la preparación de muestras de proteínas de superficie celular para el análisis de espectrometría de masas común. La segunda limitación es la dificultad para producir subtipos de células puras para generar datos de proteínas de membrana específicos del subtipo. Por último, el tercer desafío es la baja proporción de proteínas de superficie celular en proteínas de células enteras, lo que dificulta sus sensibilidades de detección mediante el análisis de espectrometría de masas.

Para superar estos problemas, desarrollamos un enfoque quimioproteómico para enriquecer e identificar selectivamente las proteínas de la superficie celular en los SSP. primarios etiquetando metabólicamente las sialoglycoproteínas^10. Para generar un número suficiente de SSP. , aprovechamos un protocolo establecido para expandir y mantener los SSP. embrionarios primarios en estados indiferenciados in vitro, co-culturando SNCCP con líneas celulares endoteliales del cerebro de ratón utilizando un soporte permeable matriz inserto(p. ej., transwell) sistema¹¹. Por el contrario, los NPSC cultivados solos sin células endoteliales generan progenie diferenciada^11,12. Por lo tanto, las muestras de proteínas de estos dos sistemas de cultivo se pueden analizar comparativamente para identificar proteínas que se expresan diferencialmente en SNCCP y neuronas diferenciadas. Como la mayoría de las proteínas de la superficie celular son modificadas por ácido siálico¹³, precursor de ácido siálico no natural análogo N-azidoacetylmannosamine-tetraacilado (Ac₄ManNAz) se utilizó para secuestrar la vía metabólica intrínseca de modo que endógena, recientemente los sialoglycans sintetizados están etiquetados con grupos de azido, generando un mango químico^14. A través de reacciones bioortogonales mediadas por azido-alquino, que conjugan biotina a sialoginas, las proteínas de la superficie celular se pueden visualizar y enriquecer para la identificación proteómica a través de un fluoróforo acoplado a la estreptavidina o matriz^14.

Aquí, realizamos la tinción del análisis de gel SDS-PAGE del sialoglycoproteome superficial de los SSPCCP expandidos en un cocultivo endotelial y diferenciando células en un sistema no co-cultivo. También purificamos selectivamente el sialoglycoproteome superficial en los dos sistemas de cultivo para la comparación proteómica. Nuestro protocolo, en comparación con los protocolos tradicionales de purificación de superficies celulares basados en centrifugación¹⁵, aumenta la eficacia de la extracción al reducir los procedimientos de extracción de proteínas superficiales a través de la conjugación y la afinidad de etiquetas específicas Purificación. Mientras tanto, aumenta la pureza de extracción de las proteínas de la superficie celular basándose en la premisa de que la sialilación ocurre principalmente en las proteínas de la superficie celular. Aunque los factores endoteliales no pueden bloquear completamente la diferenciación de los SSPLIC expandidos, el estudio comparativo entre un cocultivo y un cultivo diferenciado proporciona un método conveniente para identificar las proteínas superficiales enriquecidas con células madre sin necesidad de analizar proteínas de PNJ purificadas por FACS¹⁶. Creemos que este enfoque se puede aplicar a estudios de proteínas superficiales en otros sistemas con las modificaciones adecuadas.