זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

תאי גזע עצביים מוגדרים כאוכלוסיית תאים רב-עוצמה אשר ניתן לחדש את עצמו כדי לשמור על תא גזע הבריכה להבדיל לנוירונים ו glia. הם סוגי התא העיקריים במערכת העצבים ועשויים להציע פוטנציאל תרפויטי גדול ברפואת ההתחדשות באמצעות השתלת תאים לתוך המוח החולני והפצוע^1,2. כמו התקדמות הפיתוח, האוכלוסיה הגזע העצבי הופך הטרודוגני^3,4, ואת החלק של תאי גזע עצביים במוח בהדרגה יורדת⁵. באופן כללי, תאים גזע עובריים ותאים אחרים העצביים הנוירוני, המכונה בצורה קולקטיבית בתאי גזע ומחולל קדמון (NSPCs), ממוקמים באזורים נבטי, אזור חדרית, ואת אזור subventricular בעכברים⁶. במוח העובריים, תאי גזע עצביים ליצור נוירונים ישירות או בעקיפין באמצעות תאים ביניים מחולל (ipcs), ובמינים מסוימים דרך אזור subventricular החיצוני ושלתי (orgs)^7,8. החתימה המולקולרית הספציפית, המבנה, המיקום בנישה תא הגזע, ופוטנציאל הבידול כולם קובעים את התפקיד של כל תת-סוג באורגנוגנזה ויישומים קליניים⁹. עם זאת, הסמנים הזמינים כרגע תא אינו יכול להפלות באופן חד-משמעי ולטהר סוגים שונים של NSPCs, הגבלת ההבנה והניצול של סוגי משנה אלה.

הזיהוי של סמני פני שטח NSPCs הראשי מוגבל על-ידי שלושה מכשולים עיקריים. הראשון הוא מספר התאים המוגבלים של NSPCs ברקמה, מה שמקשה על הכנת דגימות חלבון פני השטח של התא עבור ניתוח משותף של ספקטרומטר מסה. המגבלה השנייה היא הקושי בהפקת תת תאים טהורים ליצירת תת-סוג של נתוני חלבון ממברנה ספציפיים. לבסוף, האתגר השלישי הוא היחס הנמוך של חלבונים משטח התא בחלבונים תא שלם, אשר הסלים הרגישות שלהם לזיהוי על ידי ניתוח ספקטרומטר המסה.

כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו גישה chemoproteomic באופן סלקטיבי להעשיר ולזהות חלבונים פני השטח של התאים NSPCs הראשי על ידי metabolically תיוג sialoגליקורופנים¹⁰. כדי ליצור מספר מספיק של NSPCs, ניצלנו פרוטוקול מבוסס להרחיב ולתחזק NSPCs העיקרי במצבים מובחן ב מבחנה, על ידי co-culturing NSPCs עם המוח העכבר שורות התאים באמצעות תמיכה חדיר הוספת מטריצה (למשל, transwell) מערכת¹¹. לעומת זאת, NPSCs תרבותי לבדו ללא תאים אנדותל ליצור הבדיל צאצאי^11,12. כך, דגימות חלבונים משתי מערכות התרבות האלה ניתן לנתח באופן מקרי כדי לזהות חלבונים, כי הם מבוטא באופן מהותי NSPCs והבדיל נוירונים. כמו רוב חלבונים פני השטח משתנים על ידי חומצה סילית¹³, חומצה הסילית טבעי אנלוגי מקודמן N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac₄mannaz) שימש לחטוף את השביל הפנימי מטבולית כך אנדוגניים, לאחרונה מסונתז הם מתויגים עם קבוצות azido, יצירת ידית כימית¹⁴. באמצעות azido-אלאלקין-מתווך תגובות bioorthogonal, אשר המשלים ביוטין כדי sialoglycans, תא משטח חלבונים יכול להיות דמיינו ומועשר עבור זיהוי פרוטמית באמצעות מstreptavidin מצמידים fluorophore או מטריקס¹⁴.

כאן, אנו מבצעים צביעת של SDS-דף ניתוח ג’ל של פני השטח של sialoגליקורופאז מ NSPCs התרחב בתרבות שיתוף הפעולה של אנדותל ומבדילים תאים במערכת לא שיתוף תרבות. כמו כן אנו מטהר באופן סלקטיבי את המשטח בשתי מערכות התרבות של השוואה פרוטמית. הפרוטוקול שלנו, לעומת המסורתית צנטריפוגה מבוסס משטח תא פרוטוקולים טיהור¹⁵, מגביר את היעילות החילוץ על ידי הפחתת פני השטח החילוץ הליכי הפקת באמצעות תג מסוים בניינים ואהדה טיהור. בינתיים, זה מגביר את טוהר החילוץ של חלבונים משטח התא בהתבסס על ההנחה כי הסיללציה מתרחשת בעיקר על פני השטח של התאים חלבונים. למרות שגורמי האנדותל אינם יכולים לחסום לחלוטין את הבידול של nspcs מורחב, המחקר השוואתי בין תרבות שותפה ותרבות מובחנת מספק שיטה נוחה כדי לאתר את הזהות המועשרת של תאי גזע מועשר ללא צורך ל לנתח חלבונים מ NPCs מטוהרים על ידי FACS¹⁶. אנו מאמינים גישה זו ניתן להחיל על מחקרים של חלבונים פני השטח במערכות אחרות עם השינויים המתאימים.