Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi
Summary
Burada sunulan bir in vitro nöral-endotel co-kültür sistemi ve biyoortogonal fonksiyonel gruplar ile sialoglycan metabolik birleşme birleştiren bir protokoldür primer nöral kök ve döl hücreleri genişletmek ve yüzey etiket hücre yüzey belirteçlerinin görüntüleme veya kütle spektrometresi analizi için siyaloglycoproteinler.
Abstract
Nöral kök ve progenitor hücreleri (NSPCs) beynin karmaşık yapıları ve fonksiyonları için hücresel temelidir. Onlar vivo özel nişler bulunmaktadır ve izole edilebilir ve in vitrogenişletilmiş , beyin hasarı onarmak için hücre nakli için önemli bir kaynak olarak hizmet vermektedir. Ancak, NSPCs heterojen ve açıkça moleküler düzeyde tanımlanmış ya da belirli hücre yüzey belirteçleri eksikliği nedeniyle saflaşmış değildir. Daha önce bildirilen protokol, primer NSPC’lerin yüzey siyaloglycoproteom’unun belirlenmesi için nöral-endotel ortak kültür sistemini metabolik glikan etiketleme yöntemiyle birleştirir. NSPC-endotel ortak kültür sistemi kendi kendine yenileme ve birincil NSPCCs in vitrogenişlemesi sağlar , NSPCCs yeterli sayıda üreten. Kültürlü NSPCs Sialoglycans ile doğal olmayan bir sialic asit metabolik muhabir kullanılarak etiketlenir biyoortogononal fonksiyonel gruplar. Kendi kendini yenileyen NSPC’lerden siyaloglycoproteome’yi karşılayarak endotel ortak kültüründe genişleyen ve nöral kültürü farklılaştıran bir membran proteinlerinin listesini tanımlıyoruz. Ayrıntılı olarak, protokol içerir: 1) bir NSPC-endotel ortak kültür ve NSPC ayırt edici kültür kurulumu; 2) azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz) ile etiketleme; ve 3) kitle spektrometresi analizi için nöral kültürden nöral kültür veya protein çıkarma fiksasyonu sonra görüntüleme için modifiye sialoglycan biotin konjugasyonu. Daha sonra, NSPC ile zenginleştirilmiş yüzey işaretleyici adayları, hem genişletilmiş NSPC hem de farklılaştırılmış sinir kültürlerinden kütle spektrometresi verilerinin karşılaştırmalı analizi ile seçilir. Bu protokol, başlangıç maddelerinde düşük miktarda ki membran proteinlerinin tanımlanması nda son derece hassastır ve uygun modifikasyonlarla diğer sistemlerde marker keşfine uygulanabilir.
Introduction
Nöral kök hücreler, kök hücre havuzunu korumak ve nöronlar ve glia içine ayırt etmek için kendini yenileyebilen çok güçlü bir hücre popülasyonu olarak tanımlanır. Onlar sinir sisteminde önemli hücre tipleri ve hastalıklı ve yaralı beyinlere hücre nakli yoluyla rejeneratif tıpta büyük terapötik potansiyel sunabilir1,2. Gelişme ilerledikçe, nöral kök hücre popülasyonu heterojen olur3,4, ve beyindeki nöral kök hücrelerin oranı giderek azalır5. Genel olarak konuşursak, embriyonik nöral kök hücreler ve diğer nöral progenitor hücreleri, topluca nöral kök ve progenitor hücreleri denir (NSPCs), germinal bölgelerde yer almaktadır, ventriküler bölge, ventriküler bölge, ve farelerde subventriküler bölge6. Embriyonik beyinde, nöral kök hücreler doğrudan veya dolaylı olarak ara progenitor hücreleri (IPCs) aracılığıyla nöronlar oluşturmak ve dış subventriküler bölge progenitors aracılığıyla bazı türlerde (oRGs)7,8. Spesifik moleküler imza, morfoloji, kök hücre niş konumu ve farklılaşma potansiyeli tüm beyin organogenez ve klinik uygulamalarda her alt tipin rolünü belirlemek9. Ancak, şu anda kullanılabilir hücre yüzeyi belirteçleri, bu alt tiplerin anlaşılmasını ve kullanımını sınırlayarak, farklı NSPC’lerin alt türlerini kesin olarak ayırt edemez ve arındıramaz.
Birincil NSPC’lerin yüzey işaretleyicilerinin tanımlanması üç ana engelle sınırlıdır. Bunlardan ilki dokudaki sınırlı hücre li sayıdır ve hücre yüzeyi protein örneklerini ortak kütle spektrometresi analizi için hazırlamayı zorlaştırır. İkinci sınırlama, alt tipe özgü membran protein verileri üretmek için saf hücre alt tiplerini üretmedeki zorlukdur. Son olarak, üçüncü zorluk, hücre yüzeyproteinlerinin tüm hücre proteinlerindeki düşük oranıdır, bu da kütle spektrometresi analizi ile algılama hassasiyetlerini engellemektedir.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, siyonlycoproteinleri metabolik olarak etiketleyerek primer NSPC’lerde hücre yüzeyproteinlerini seçici olarak zenginleştirmek ve tanımlamak için kemoproteomik bir yaklaşım geliştirdik10. Yeterli sayıda NSPC oluşturmak için, permeable destek kullanarak fare beyin endotel hücre hatları ile birlikte nspcs birlikte tokuş ederek, in vitro farklılaşmamış devletlerde birincil embriyonik NSPCs genişletmek ve korumak için kurulmuş bir protokol yararlandı matris insert(örneğin, transwell) sistem11. Buna karşılık, ENDOTEL HÜCRELERI olmadan tek başına kültürlü NPSCs diferansiye döloluşturmak 11,12. Böylece, bu iki kültür sisteminden alınan protein örnekleri, NSPC’lerde ve farklılaştırılmış nöronlarda farklı olarak ifade edilen proteinleri tanımlamak için karşılaştırmalı olarak analiz edilebilir. Çoğu hücre yüzey proteinleri siyalik asit13tarafından modifiye edilir gibi , doğal olmayan siyalik asit öncüsü analog N-azidoacetylmannosamine-tetraacylated (Ac4ManNAz) içsel metabolik yolu kaçırmak için kullanıldı böylece endojen, yeni sentezlenmiş siyaloglikanlar azido grupları ile etiketlenir, kimyasal sapı üreten14. Azido-alkyne aracılı biyoortogonoal reaksiyonlar sayesinde, hangi sialoglycans için biotin conjugate, hücre yüzey proteinleri görselleştirilmiş ve bir streptavidin-çiftli florofor veya matris14ile proteomik tanımlama için zenginleştirilmiş olabilir.
Burada, NSPCs yüzey sialoglycoproteome yüzey sialoglycoproteome boyama gerçekleştirmek bir endotel co-kültür ve olmayan bir co-kültür sisteminde hücreleri ayırt. Ayrıca proteomik karşılaştırma için iki kültür sisteminde yüzey siyaloglycoproteme’yi seçici olarak arındırıyoruz. Protokolümüz, geleneksel santrifüj tabanlı hücre yüzeyi saflaştırma protokolleri15ile karşılaştırıldığında, belirli etiket çekimi ve afinite ile yüzey protein çıkarma prosedürleriazaltarak ekstraksiyon etkinliğini artırır Arıtma. Bu arada, sialylation çoğunlukla hücre yüzeyi proteinleri olur öncül dayalı hücre yüzeyi proteinlerinin ekstraksiyon saflığı artırır. Endotel faktörleri genişletilmiş NSPC’lerin farklılaşmasını tamamen engelleyemese de, ortak kültür ve farklılaştırılmış kültür arasındaki karşılaştırmalı çalışma, kök hücre ile zenginleştirilmiş yüzey proteinlerini FACS16tarafından saflaştırılmış NPCs gelen proteinleri analiz. Bu yaklaşımın uygun modifikasyonlarla diğer sistemlerdeki yüzey proteinlerinin çalışmalarına uygulanabileceğine inanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yüzey işaretleri genellikle etiket ve in vitro ve in vivo17,18belirli hücre tipleri arındırmak için kullanılır. Yüzey belirteçlerinin keşfi, bir kök hücre popülasyonunun normal veya patolojik dokulardan ve kültür yemeklerinden seçici olarak zenginleştirilen moleküler araçlar sağlayarak, arınmış bir hücre sunarak yenileyici tıp ve kök hücre araştırmalarına büyük katkıda bulunur. biyolojik özelliklerin klinik kullanımı veya ince…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şekil 1B, 1C, 1E ve 1F Bai’den üretilir ve ark . 10.000 Kraliyet Kimya Derneği’nin izniyle. X.C.’nin laboratuvarındaki Yi Hao’ya figür düzenlemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 91753206 Q. S. ve X. C., No. 31371093 Q. S. ve No. 21425204 ve 21672013 x. C.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| BEND3 | ATCC | CRL-229 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 1% |
| Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | 1% |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | 1 to 100 |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A7250 | 1 mM |
| Papain | Worthington | LS003726 | 10 U/mL |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | 1 to 50 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| basic Fibroblast growth factor | Gibco | PHG0261 | 10 ng/mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 1% |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | 10% |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| Tripsin-EDTA, 0.25% | Gibco | 25200056 | |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Transwell | Corning | 3450 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% |
| Sucrose | Sangon | A100335 | |
| DAPI | Gibco | 62248 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| SDS-PAGE loading buffer 2X | Solarbio | P1018 | |
| 6-well plate | Corning | 3335 | |
| Tris-Glycine protein gel | invitrogen | xp00100box | |
| mouse monoclonal anti-Nestin | Developmental Study Hybridoma Bank | Rat-401 | 1 to 20 |
| mouse monoclonal anti-beta-tubulin III | Sigma | T8860 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 | invitrogen | A-21121 | 1 to 1000 |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG2b | invitrogen | A-21143 | 1 to 1000 |
| Albumin Bovine V | Amresco | 0332 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Brij97 | Aladdin | B129088 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| alkyne-biotin | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| BTTAA | Click Chemistry Tools | 1236 | |
| Ac4ManNAz | Click Chemistry Tools | 1084 | 100 µM |
| 9AzSia | synthesized in lab | ||
| sodium ascorbate | Sigma | A4034 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| EDTA | Sangon | A100322 | |
| NaCl | Sangon | A100241 | |
| SDS | Sangon | A100227 | |
| Alexa Flour 647-conjugated streptavidin | invitrogen | S21374 | 1 to 1000 |
| Triethanolamine | Sigma | V900257 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | invitrogen | 60210 | |
| ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Thermo Scientific | 20278 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | 970-00026-00 | |
| DNase I | Sigma | DN25 | 12 µg/mL |
| urea | Sigma | U5378 |
References
- Weissman, I. L. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural Stem Cells: Generating and Regenerating the Brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Gal, J. S. Molecular and Morphological Heterogeneity of Neural Precursors in the Mouse Neocortical Proliferative Zones. Journal of Neuroscience. 26, 1045-1056 (2006).
- Kawaguchi, A., et al. Single-cell gene profiling defines differential progenitor subclasses in mammalian neurogenesis. Development. 135, 3113-3124 (2008).
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, 1535-1546 (2012).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The Glial Nature of Embryonic and Adult Neural Stem Cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Wang, X., Tsai, J. W., LaMonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nature Neuroscience. 14, 555-561 (2011).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Bai, Q. R., Dong, L., Hao, Y., Chen, X., Shen, Q. Metabolic glycan labeling-assisted discovery of cell-surface markers for primary neural stem and progenitor cells. Chemical Communications. 54, 5486-5489 (2018).
- Shen, Q., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28, 69-80 (2000).
- Varki, A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteins. Nature. 446, 1023-1029 (2007).
- Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
- Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
- Schmidt, J. R., et al. Pilot Study on Mass Spectrometry-Based Analysis of the Proteome of CD34+CD123+ Progenitor Cells for the Identification of Potential Targets for Immunotherapy in Acute Myeloid Leukemia. Proteomes. 6, (2018).
- Crisan, M., Dzierzak, E. The many faces of hematopoietic stem cell heterogeneity Development. Development. 144, 4195-4195 (2017).
- Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 14720-14725 (2000).
- Qin, W., et al. Artificial Cysteine S-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides during Metabolic Glycan Labeling. Angewandte Chemie International Edition. , (2018).
- Gry, M., et al. Correlations between RNA and protein expression profiles in 23 human cell lines. BMC Genomics. 10, 365 (2009).
- Hennen, E., et al. A LewisX Glycoprotein Screen Identifies the Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) as a Modulator of Oligodendrogenesis in Mice. Journal of Biological Chemistry. 288, 16538-16545 (2013).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 473-483 (2006).
- O’Brian, C. A., Chu, F. ReviewPost-translational disulfide modifications in cell signaling—role of inter-protein, intra-protein, S-glutathionyl, and S-cysteaminyl disulfide modifications in signal transmission. Free Radical Research. 39, 471-480 (2005).
- Williamson, A. J. K., Whetton, A. D. The requirement for proteomics to unravel stem cell regulatory mechanisms. Journal of Cellular Physiology. 226, 2478-2483 (2011).
- Christensen, B., et al. Cell Type-specific Post-translational Modifications of Mouse Osteopontin Are Associated with Different Adhesive Properties. Journal of Biological Chemistry. 282, 19463-19472 (2007).
- Yanagisawa, M., Yu, R. K. The expression and functions of glycoconjugates in neural stem cells. Glycobiology. 17, 57R-74R (2007).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
