Yüksek çözünürlüklü desenli biyofilm ifade kullanarak pDawn-Ag43

1. pDawn-Ag43 bakteri suşları hazırlanması PDawn-Ag43 bir ilgi (Şekil 1) e.coli suşu dönüşümü. PDawn-Ag43 plazmid (plazmid depodan elde edilebilecek) 50 μg/mL spektinomisin (LB + spec) (gecede, titreyen bir kuluçka ~ 250 rpm, 37 ° C) bir kültür tüp ile takıma LB suyu zorlanma aşı barındırma bir klonlama yük büyümek. Sonra bir miniprep kit saf pDawn-Ag43 plazmid10hasat için kullanın. Bir E. coli zorlanma desenli ilgi seçin. Şimdiye kadar pDawn-Ag43 MG16553 ve BW25113 çalışmak için doğrulandı. Yetkili oluşturmak için oluşturulmuş protokol kullanın (Örneğin, kimyasal olarak yetkili11 -electrocompetent12) seçilmiş hisse senetleri e.coli suşu (Örneğin, MG1655). PDawn-Ag43 plazmid yetkili bakteri11,121 saat kurtarma ve plaka tarafından takip LB + spec ağar kaplamalar, dönüştürün. Koloniler gecede 37 ° C’de büyümeye izin Mağaza pDawn Ag43 suşları dönüştürdü. PDawn-Ag43 bir LB üzerinden bir koloni aşılamak + agar plaka LB spec + suyu bir kültür tüp spec ve üssel faz (OD600 ~0.4 – 0.8) için titreyen bir kuluçka (~ 250 rpm, 37 ° C)’de büyür. Hisse senedi uzun vadeli-80 ° C’de pDawn-Ag43 dönüştürülmüş zorlanma kültürünün 1 mL 1 mL cryo-tüp dondurucu hisse senedi % 25 gliserol elde etmek içinde % 50 steril Gliserin ile karıştırılarak depolamak için hazırlayın. Bu-80 ° C dondurucuda saklayın. Ek plazmid (Örneğin, floresan muhabir plazmid) dönüştürülmesi, yetkili hücreleri11,oluşturmak gerekirse12 pDawn-Ag43 den zorlanma değiştirdi ve dönüştürme işlemi11 tekrar , 12 ek plazmid gerektiği gibi.Not: Elektroporasyon8kullanıyorsanız, bu cotransform (pDawn-Ag43 dahil) aynı anda birden fazla plazmid mümkündür; Ancak, pDawn-Ag43 büyük boy (> 10 kB) dönüşüm verimliliği azalır aracı olarak eş zamanlı dönüşüm kimyasal dönüştürme yöntemleri kullanarak önerilmez. 2. aydınlatıcı bakteriler için projektör optik Set-up hazırlanması Kablolar, taşınabilir projektörüne montaj ve bakteriyel inkübatör içinde işleyen kabil iletilmesi için bakteriyel bir kuluçka makinesi saydam olmayan duvarlar ve bir delik ile elde etmek ve bir dizüstü bilgisayar için sunum-projeksiyon (bakınız tablo, yazılım ile donatılmış Malzemeler). Projektör ve kuluçka makinesi seçerken, bu projektörün minimum odaklama mesafesi kuluçka makinesi iç yüksekliği daha az olduğundan emin olun. Biyofilm kültür odası nerede tavan, yukarı doğru (Şekil 2) bağlı doğrudan altındaki diyafram işaret ile projektör kuluçka makinesi içine yerleştirin. Projektörün yerde bir set-up optik bir breadboard temel ile inşa tarafından dikey bir mesaja bağlı düzeltme sırayla bağlı yatay bir mesaja hangi vida projektör (Şekil 2). Not Bu kurulum projektör/kullanılabilir bölümleri bağlı olarak değiştirilebilir. Sonuçta, projektör sağlam yukarı işaret diyafram ile kuluçka makinesi, alt yakınlarında sabittir anahtar gereksinimi olduğunu. Laptop yolu ile ekran kablosunu (Örneğin, HDMI) kuluçka makinesi içinde projektör bağlanın. Eğer yüzeyleri — özellikle tavan — yansıtıcı (Örneğin, metal cilalı yüzey), kuluçka makinesi iç vardır onları yansımaları en aza indirmek için karanlık mat yüzey ile koruyun. Teyp bir boş ‘aptal’ kültür bulaşık kuluçka makinesi tavana bağlamak için kullanın. Unutmayın, tasarı ile olduğu gibi kültür çanak eklemek için birden çok kabul edilebilir yolları; aydınlatma oluştuğu, kültür odası şeffaf alt yüzeyine kapsamında değildir olun. Projektörün odaklanmak böylece kuluçka (Şekil 2) tavana bağlı alt yüzeyine biyofilm kültür çanak (Örneğin, iyi bir tabak) ile odaklama uçak denk odaklama düğmeyi çevirerek ayarlayın. Projektörün keskin, bulanık olmayan görüntü alt kültür yemeğin üzerine aydınlatmak. Projeksiyon optimize edilmiş bir kez ‘aptal’ kültür çanak çıkarın. Dizüstü bilgisayar yazılımı kullanarak doğrudan en çok mavi aydınlatmalı tam görüş alanı aydınlatmak için projektör (Örneğin, RGB = [0, 0, 255]) tam mavi bir slayt sunarak. Photodetector kafa kuluçka tavana yerleştirip yoğunluğu ışık dalga boyu 460 nm için kalibre karşılık gelen güç metre üzerinde okuma bir optik güç ölçeri kullanmayı projektör aydınlatma yoğunluğunu ölçmek. Bağlanma ve photodetector kullanılan belirli güç metre için ayarlama yönergeleri izleyin. Ortam ışığı azaltmak (Örneğin, oda ışıkları kapatın veya kuluçka makinesi ışık kaynaklarından uzak yer) aydınlatma yoğunluğu ölçüm yapmadan önce mümkün olduğu kadar. Projektör diyafram açıklığında yerleştirilen bir ayarlanabilir nötr yoğunluk filtresi kullanarak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın. Mavi ışık öngörülen bölge merkezi Aydınlatma şiddeti 50 μW/cm2okur kadar güç ölçer tarafından ölçülen aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın için filtre döndürün.Not: yazılım ucunda düşük mavi RGB değerleri kullanarak aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın mümkün iken, mavi RGB değeri maksimize sistem optik kontrast ışıklı vs arasında en üst düzeye çıkarma avantajı varken bir filtre kullanarak. karanlık bölgeler. Dizüstü bilgisayarda sunum/projektör yazılım kullanarak rasgele desenleri çizmek ve bu desenleri projektör kullanarak da kuluçka tavanda görüntüler.Not: Biyofilm oluşturan bölgeler ile en fazla mavi aydınlatma çizilmesi (Örneğin, RGB = [0, 0, 255]), biyofilm şekillendirme bölgeleri yok aydınlatma ile (Örneğin, RGB = [0, 0, 0]). 3. desenli biyofilmler kültür Aydınlatma önce güvenilir bir şekilde geç üstel büyüme faz aydınlatma (Şekil 3A) için indüklenir gliserol dondurucu stoktan başlatılıyor pDawn-Ag43 bakterileri hazırlayın. PDawn-Ag43 zorlanma LB + spec agar levha üzerine gliserol stoktan çizgi. Koloniler büyümeye izin geceleme (37 ° C).Not: hücreler karanlıkta kalmak mümkün olduğu kadar aydınlatma kültür adım kadar buradan olun — kısa dönemlerde ortam aydınlatma (Örneğin, subdilution için) kabul edilebilir. LB bir agar tabağına bakterilerden pDawn-Ag43 bir koloni aşılamak + suyu spec ve kültürü (içinde ~ 16 h için sallayarak kuluçka makinesi ~ 250 rpm, 37 ° C) durağan faz gecede büyümeye. Kültür 1:1,000 LB ile oranında, subdilute + spec suyu (Örneğin, taze LB + spec için 1 mL 1 μL gecede kültür ekleyin). Subdiluted kültür geç üstel/erken durağan faz (OD ~ 1.0, titreyen bir kuluçka ~ 6 h ~ 250 rpm, 37 ° C) kadar büyümeye izin. Büyümeye kültür için beklerken, M63 medya 1 x M63 tuzları, 1 mM MgSO4, % 0,2 glikoz, % 0,1 casamino asitler ve 50 μg/mL spektinomisin su hazırlamak (kurucu parçaları steril emin olun). 1: 100 oranında geç üstel-fazlı kültür 50 μg/mL spektinomisin ile desteklenmiş M63 medya ile subdilute. Sonra bir biyofilm kültür çanak içine seyreltme tanıtmak (Örneğin, seyreltilmiş örnek iyi bir tabak pipette).Not: Bu 1: 100 subdilution için gerekli birimler kullanılan kültür çanak üzerinde bağlıdır (Eğer 6-şey polistren iyi tabak [Sigara-doku-tedavi kültürü], tek bir örnek kullanarakÖrneğin, kültür 20 μL M63 + spec, 2 mL olarak ekleyerek gerektirecektir Standart iyi 6-şey plaka ~ 2 mL birimdir). Örnekleri şimdi aydınlatma için hazır olduğu gibi kültür tabak çanak alt yüzey aşağıdan tarafından projektör aydınlatma için şeffaf olduğu inkübatör, tavana teyp.Not: Kuluçka makinesi tavan sokak aydınlatma en aza indirmek için yansıtıcı değil emin olmak önemlidir. Sokak aydınlatma de azaltılmış kültür yemekleri olarak siyah duvarlı plakaları kullanarak ancak bu kesinlikle gerekli değildir — böyle plakaları kullanıyorsanız, alt yüzeyinin şeffaf sağlayın. Kültürüne biyofilmler kuluçka gecede (16 h sallama yok, 37 ° C’de ile) izin verir. Not Bazı projektörler daha yüksek sıcaklıklarda daha az güvenilir olacaktır. Bu durumda, kuluçka süresi, e.coli suşu bağlı olarak arttırılması gerekebilir unutmayın Kültür (Örneğin, 30 ° C), daha düşük sıcaklıklarda tutmak. 4. görüntüleme biyofilmler desenli Biyofilm örnekleri gecede büyüme sonra kültür bulaşık kuluçka makinesi kaldırın. Çanak alt yüzeyi bağlı biyofilm bakteri nerede o ışıklı, hem de yukarıdaki sıvı medyada dağınık planktonik bakteri var. Planktonik hücreler kültür çanak (bir pipet ile hafifçe alıyorum tarafındanÖrneğin,) sıvı medya kaldırarak atmak. Örnek 2 durulama x yavaşça PBS, pipetting tarafından kalan planktonik hücreleri (Şekil 3B) kaldırmak için bir fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm ile aspirasyon tarafından takip. Hücreleri fluorescently etiketlediyseniz, floresans mikroskobu13 (Örneğin, geniş alanlı13, 3-b confocal14, vb) kullanarak örnekleri doğrudan görüntü.Not: Floresan biyofilmler bir kendi kendine sağlamlaştırma montaj orta kullanarak da korunabilir. Bir biyofilm örnek medyaya montaj bir damla uygulamak, herhangi bir kabarcıklar altında yakalamak için değil dikkat çekici bir cam coverslip ile kapak ve gecede görüntüleme önce sertleşmesine izin. Kullanılan bakteri hücreleri fluorescently etiketlenir değil, kristal Mor leke tekniği15 (biyofilm kontrastı artırmak için,Şekil 3B) görüntüleme önce uygulanır. 5. iletişim kuralı değişiklikler/alternatifleri PDawn-Ag43 bakteri farklı yüzeylerde büyümek. Cam ya da koymak poli-dimetil-siloxane (PDMS) kupon (Örneğin, coverslips veya ince şeritler PDMS) bakteriyel bir örnek/aydınlatma eklenmesi önce iyi tabak içine ve aynı iletişim kuralını daha önce olduğu gibi desen pDawn-ag43 biyofilmler için camın üzerine izleyin. ve PDMS. Şeffaf ve kapalı kültür odası içindeki pDawn-Ag43 bakterileri büyümek. Bir kültür odası kalıp için PDMS oluşturmak. Temel kültür odası için kalıp sert, dikdörtgen prizma (prizma kalıp döküm bir kez kültür odası hizmet veren PDMS bir boşluk olacak) düz bir yüzey ekleyerek oluşturun. Daha karmaşık kültür odası kalıpları kullanarak yumuşak litografi16fabrikasyon unutmayın. PDMS kalıp içine dökme ve tedavi izin PDMS kavite döküm (detaylı yumuşak litografi iletişim kuralı için Jüpiter’ın bilim eğitim veritabanı16) bakın. Kür sonra herhangi bir aşırı PDMS trim, kavite/kültür odasına giriş/çıkış kanalları yumruk ve düz bir yüzey (Örneğin, cam/Polistiren) için boşluğu sıkıca yüzeyi arasında kalan boşluk bırakarak PDMS düz yüzey üzerine basarak bağ ve biyofilm kültür odası olarak PDMS tavan.Not: daha kalıcı bağ plazma tedavi16 tarihinde göre de kullanılabilir, ancak fişleri sonra yeniden kullanılabilir olmayacaktır. Bir şırınga künt ipucu iğneler (yerine bir pipet) ile kültür odası/durulama PBS arabelleği (Şekil 3 c) ile içine bakteriyel örnek tanıtmak için kullanmadan önce kültür protokolü olarak izleyin. Geçici olarak bağlanmış bir boşluğu kullanıyorsanız, yalnızca negatif basınç sıvı içine/out kavite temel cam/polistiren yüzeyden gümrüksüz haline gelmediğinden emin olmak için odasının, çekmek için kullanın. PDawn-Ag43 bakteri bir film photomask için yapılandırılmış aydınlatma kullanarak büyümek. Bir film photomask yazıcı/yazıcı hizmeti ile uyumlu yazılım kullanarak bir biyofilm desen tasarım. Photomask film tasarımı başka bir yerde nerede biyofilm yazdırılması gereken bölgelerde açık ve siyah/opak olmalıdır. Tamamlandığında, photomask dosya yazıcı/yazdırma servisine gönderebilir ve fiziksel photomask dönüşü bekliyor. Tam bir görüş alanı en fazla mavi aydınlatmalı aydınlatmak için projektör talimat (Örneğin, RGB = [0, 0, 255]) dizüstü bilgisayar yazılımı kullanma. Bir bölge daha büyük film photomask ve bu doğrudan biyofilm kültür dibine çanağı gece aydınlatma (şekil 3D) için bakteriyel örnek tanıtan önce teyp dan ilgi kesip. Daha önce olduğu gibi biyofilmler kültür ve photomask kültür sonra görüntüleme önce kaldırın.