Alta resolución con motivos Biofilm deposición utilizando pDawn-Ag43

1. preparación de las cepas bacterianas de pDawn-Ag43 PDawn-Ag43 se transforman en una cepa de e. coli de interés (figura 1). Cultivar una cepa clonación hosting pDawn Ag43 plásmido (disponibles en un repositorio de plásmido) al inocular la cepa en caldo LB suplementado con espectinomicina de 50 μg/mL (LB + spec) en un tubo de cultivo (durante la noche en un incubador de agitación a 250 rpm, 37 ° C). A continuación, utilice un kit de miniprep para cosechar el plásmido purificado pDawn-Ag43 del10. Elegir una cepa de e. coli de interés para ser modelado. Hasta el momento, pDawn-Ag43 ha sido verificada en MG16553 y BW25113. Utilizar un protocolo establecido para generar competentes (por ejemplo, químicamente competentes11 o espectro12) las existencias de los elegidos e. coli cepa (p. ej., MG1655). Transformar pDawn Ag43 plásmido en la bacteria competente11,12, seguidas de la recuperación de 1 h y placa de LB + las placas de agar especificaciones. Permitir que las colonias al crecer durante la noche a 37 ° C. Tienda pDawn-Ag43 transforma las cepas. Inocular una colonia única de pDawn-Ag43 de una LB + espec. placa de agar en LB + especificaciones caldo en un tubo de cultivo y crecer en un incubador de agitación (a 250 rpm, 37 ° C) a la fase exponencial (OD600 ~0.4 – 0.8). Preparar la bolsa para almacenar la tensión transformada de pDawn-Ag43 a-80 ° C a largo plazo mezclando 1 mL de cultivo con 1 mL de glicerol estéril de 50% en un cryo-tubo para obtener un 25% de glicerol acción de congelador. Guarde en un congelador de-80 ° C. Si plásmidos adicionales (p. ej., plásmidos reportero fluorescente) necesitan transformarse, crear células competentes11,12 de pDawn-Ag43 transforma la tensión y repetir el proceso de transformación11 , 12 para plásmidos adicionales según sea necesario.Nota: Si utiliza la electroporación8, es posible cotransform múltiples plásmidos (incluyendo pDawn-Ag43) simultáneamente; sin embargo, una transformación simultánea no se recomienda métodos de transformación química, como el de gran tamaño (> 10 kB) de pDawn-Ag43 se reduce la eficiencia de transformación. 2. preparación de la configuración óptica del proyector para iluminar las bacterias Obtener una incubadora bacteriana con paredes no transparentes y un orificio para pasar cables, un proyector portátil capaz de montaje y funcionamiento dentro de la incubadora bacteriana, y un ordenador portátil equipado con el software para presentación de proyección (véase tabla de Materiales). Al elegir el proyector y la incubadora, asegúrese de que la distancia de enfoque mínima del proyector está a menos de la altura interior de la incubadora. Coloque el proyector dentro de la incubadora en la parte inferior, con la abertura apuntando directamente hacia arriba, al techo, donde la cámara de cultura del biofilm está había conectado (figura 2). Fijar el proyector en su lugar mediante la construcción de una instalación con una placa óptica base conectado a un poste vertical, a su vez conectado a un poste horizontal que tornillos en el proyector (figura 2). Tenga en cuenta que esta configuración puede modificarse dependiendo de las piezas del proyector/disponible. En definitiva, el requisito clave es que el proyector se fija sólidamente en la parte inferior de la incubadora, con la abertura hacia arriba. Conecte la laptop mediante el cable de la pantalla (por ejemplo, HDMI) el proyector dentro de la incubadora. Si las superficies — especialmente el techo, del interior de la incubadora son reflexivo (p. ej., superficie de metal pulida), cubrir con superficies mates oscuras para reducir al mínimo reflexiones. Utilice cinta para conectar un plato vacío de cultura ‘dummy’ para el techo de la incubadora. Tenga en cuenta que, como con el proyector, hay múltiples maneras aceptables para colocar una placa de cultivo; Asegúrese de que la superficie del fondo transparente de la cámara de la cultura, donde se produce la iluminación, no está cubierta. Ajuste el enfoque del proyector girando la perilla de enfoque para que los plano de enfoque coincide con la superficie inferior de la placa de cultivo de biofilm (p. ej., un plato bien) en el techo de la incubadora (figura 2). El proyector debe iluminar una imagen fuerte, no borrosa en la parte inferior de la placa de cultivo. Retire la placa de cultivo ‘dummy’ una vez que se ha optimizado la proyección. Utilizando el software de la laptop, directo del proyector para iluminar todo el campo de visión con iluminación azul máxima (p. ej., RGB = [0, 0, 255]) mediante la presentación de una diapositiva completa azul. Medir la intensidad de iluminación del proyector usando un medidor de potencia óptica colocando la cabeza del fotodetector en el techo de la incubadora y lectura de la intensidad en el medidor de energía correspondiente, calibrada a luz de longitud de onda 460 nm. Siga las instrucciones de conectar y calibrar el fotodetector para el medidor de potencia específica utilizado. Reducir la luz ambiental (por ejemplo, apagar luces de la habitación, o colocar la incubadora lejos de fuentes de luz) tanto como sea posible antes de realizar la iluminación medidas de intensidad. Ajustar la intensidad de iluminación utilizando un filtro de densidad neutra ajustable colocado en la abertura del proyector. Gire el filtro para ajustar la intensidad de iluminación, medida por el medidor de energía, hasta que la intensidad de iluminación en el centro de la región proyectada luz azul 50 μW/cm2.Nota: Mientras que es posible ajustar la intensidad de iluminación mediante los valores RGB azul inferiores en el extremo de software, utilizando un filtro mientras que maximiza el valor RGB azul tiene la ventaja de maximizar el contraste óptico del sistema entre iluminados vs . las regiones oscuras. Dibujar patrones arbitrarios usando el software de presentación/proyector en el ordenador portátil y mostrar estos patrones en el techo de la incubadora, utilizando el proyector.Nota: Regiones de formación de Biofilm deben extraerse con máxima iluminación azul (p. ej., RGB = [0, 0, 255]), regiones de formación de biofilm no con ninguna iluminación (p. ej., RGB = [0, 0, 0]). 3. cultivos con biopelículas Antes de la iluminación, preparar las bacterias pDawn-Ag43, a partir de la acción de congelador de glicerol, para que ellos se inducen confiablemente en la última fase de crecimiento exponencial para la iluminación (Figura 3A). Raya una cepa de pDawn-Ag43 de stock de glicerol en LB + las placas de agar especificaciones. Permitir que las colonias que crecen durante la noche (37 ° C).Nota: Desde aquí hasta el paso de la cultura de la iluminación, asegúrese de que las células permanecen en la oscuridad tanto como sea posible, breves períodos en el ambiente iluminación (por ejemplo, para subdilution) son aceptables. Inocular una colonia de bacterias pDawn-Ag43 de una placa de agar en LB + caldo de especificaciones y crecer la cultura de la noche a la fase estacionaria (en un incubador de agitación a 250 rpm, 37 ° C, ~ 16 h). Subdilute la cultura en una relación de 1:1,000 con LB + caldo de especificaciones (p. ej., añadir 1 μL de la cultura durante la noche a 1 mL de LB fresco + spec). Permita que la cultura subdiluted a crecer hasta la última fase estacionaria exponencial temprano (OD ~ 1.0, ~ 6 h en un incubador de agitación a 250 rpm, 37 ° C). Espera de la cultura crecer, preparar medios M63 1 x M63 sales 1 mM MgSO4, glucosa 0,2%, 0,1% casamino ácidos y espectinomicina 50 μg/mL en agua (Asegúrese de que las partes constituyentes son estériles). Subdilute la cultura de la última fase exponencial en una proporción de 1: 100 con medios M63 suplementados con 50 espectinomicina μg/mL. Luego, introducir la dilución en una placa de cultivo de biofilm (p. ej., pipetear la muestra diluida en una placa bien).Nota: Los volúmenes requeridos para este subdilution de 1: 100 dependen de la placa de cultivo se utiliza (por ejemplo, si utiliza una placa poliestireno 6-bien de bien [no–cultivo de tejidos Tratado], una sola muestra requiere agregar 20 μL de cultivo 2 ml de M63 + spec, como la volumen pozo de una placa de 6 pozos es de ~ 2 mL). Como las muestras están ahora listas para la iluminación, cinta de la placa de cultivo en el techo de la incubadora, asegurándose de que la superficie en la parte inferior del plato es transparente para la iluminación desde abajo por el proyector.Nota: Es importante asegurarse de que el techo de la incubadora no es reflexivo, para reducir al mínimo la iluminación callejero. Iluminación callejero también puede reducirse mediante el uso de las placas de pared negro como platos de la cultura, aunque no es estrictamente necesario, si utiliza tales placas, asegurar la superficie inferior es transparente. Permiten las biopelículas a la cultura en la incubadora durante la noche (16 h con ninguna agitación a 37 ° C). Tenga en cuenta que algunos proyectores se convierten en menos confiables a temperaturas más altas. Si es el caso, cultura a temperaturas más bajas (p. ej., 30 ° C), teniendo en cuenta que el tiempo de incubación puede necesitar ser aumentada, dependiendo de la cepa de e. coli . 4. proyección de imagen de estampado Biofilms Después del crecimiento durante la noche de las muestras de la biopelícula, retire la placa de cultivo de la incubadora. El plato tendrá biofilm las bacterias a su superficie inferior que ha sido iluminado, así como bacterias planctónicas dispersadas en el medio líquido anterior. Deseche las células planctónicas quitando el medio líquido de la placa de cultivo (por ejemplo, aspirando suavemente con una pipeta). Enjuague la muestra 2 x con una solución de tampón fosfato salino (PBS) para eliminar las células planctónicas restantes (figura 3B) transfiriendo suavemente en PBS, seguido de aspiración. Si las células se han etiquetado fluorescente, imagen directamente las muestras usando fluorescencia microscopía13 (p. ej., todo el campo13, confocal 3D14, etc.).Nota: Biofilms fluorescentes puede también conservarse usando un medio de montaje autoendurecible. Aplique una gota de los medios de comunicación a una muestra de biofilm de montaje, cubrir con un cubreobjetos de vidrio, teniendo cuidado de no para capturar las burbujas por debajo y a endurecerse durante la noche antes de la proyección de imagen. Si las células bacterianas no son etiquetadas fluorescente, aplique cristal violeta colorante técnica15 (figura 3B) para mejorar el contraste de la biopelícula antes de la proyección de imagen. 5. Protocolo de modificaciones/alternativas Crecen las bacterias pDawn-Ag43 sobre diferentes superficies. Poner cristal o poli-Dimetil-Siloxano (PDMS) cupones (por ejemplo, cubreobjetos o tiras delgadas de PDMS) en placas de pozos antes de la adición de una muestra bacteriana/iluminación y seguir el mismo protocolo como antes a patrón pDawn ag43 biofilms en vidrio y PDMS. Crecen bacterias pDawn Ag43 dentro de una cámara transparente, incluida la cultura. Generar un molde de la cámara de cultura para PDMS. Para un compartimiento de la cultura básica, generar molde colocando un prisma rectangular, duro a una superficie plana (el prisma se convertirá en una cavidad en el PDMS que sirve como el compartimiento de la cultura una vez que el molde se echa). Tenga en cuenta que más intrincada cultura cámara moldes pueden fabricarse utilizando litografía blanda16. Molde una cavidad PDMS de PDMS que vierte en el molde y dejar que se cure (un protocolo detallado de litografía blanda, ver base de datos de ciencia educación16 de JoVE). Después de curar, recortar cualquier exceso PDMS, perforar canales de entrada y salida en la cámara de la cavidad/de la cultura y de bonos de la cavidad a una superficie plana (p. ej., vidrio/poliestireno) apretando con fuerza el PDMS en la superficie plana, dejando la cavidad entre la superficie y el techo de PDMS como la cámara de cultura del biofilm.Nota: También se puede utilizar la vinculación más permanente basada en plasma tratamiento16 , pero los chips no serán reutilizables. Seguir el protocolo de la cultura como antes, utilizando una jeringa con agujas de punta Roma (en vez de una pipeta) para introducir la muestra bacteriana en el cámara de cultura/enjuague con tampón PBS (figura 3). Si usa una cavidad temporal servidumbre, use presión negativa sólo tirar líquido en/fuera de la cámara, para asegurarse de que la cavidad no sea no adherente de la superficie de vidrio/poliestireno subyacente. Crecer pDawn Ag43 bacterias usando un photomask película para iluminación estructurada. Diseño de un modelo de biofilm mediante software CAD compatible con un servicio de impresora e impresión de película photomask. El diseño de la película de fotomáscara debe ser claro en las regiones donde el biofilm está destinado a ser impreso y negro/opaco en otros lugares. Cuando termine, envíe el archivo de fotomáscara al servicio de impresión de la impresora y esperan el regreso de la fotomáscara física. Instruir el proyector para iluminar un campo de visión completo con iluminación azul máxima (p. ej., RGB = [0, 0, 255]) utilizando el software de ordenador portátil. Recortar una región de interés de la más grande película photomask y cinta directamente a la parte inferior de la cultura de biofilm del plato antes de la introducción de la muestra bacteriana para la iluminación durante la noche (figura 3D). Cultura los biofilms como antes y el photomask después cultivo, antes de la proyección de imagen.