高解像度使用してバイオ フィルム成膜のパターンの pDawn Ag43

1. pDawn Ag43 菌株の調製 興味 (図 1) の大腸菌の菌株に pDawn Ag43 を変換します。 流体培養基 LB (ポンド + 仕様) の 50 μ g/mL スペクチノマイシン (37 ° C 〜 250 rpm での振動インキュベーター) で一晩培養管の添加でひずみを接種 pDawn Ag43 プラスミド (プラスミド リポジトリから入手可能) をホストしているクローン株を成長します。その後、精製 pDawn Ag43 プラスミド10を収穫するのに miniprep キットを使用します。 パターンに関心の大腸菌の菌株を選択します。これまで、pDawn Ag43 MG16553と BW25113 で動作するように検証されました。 主務を生成する確立されたプロトコルを使用して (例えば、化学的に有能な11または electrocompetent12) 選ばれた株大腸菌の菌株 (例えばMG1655)。 PDawn Ag43 プラスミドを有能な細菌11,12LB + スペック寒天 1 h 回復とプレートの順に変換します。37 ° C で一晩培養するコロニーを許可します。 ストア pDawn Ag43 変換系統です。 LB から pDawn Ag43 の単一コロニーを接種 + LB に寒天培地を仕様 + 培養管のスープを仕様し、指数段階 (OD600 ~0.4 – 0.8) に (~ 250 rpm、37 ° C) で振動のインキュベーターで成長します。 冷凍庫ストック 25% グリセロールを取得するクライオ チューブで 50% 滅菌グリセリン 1 mL で文化の 1 mL を混合することによって長期-80 ° c pDawn Ag43 変形ひずみを格納する在庫を準備します。-80 ° C のフリーザーでこれを保管します。 12 pDawn Ag43 からひずみの変換し、変換プロセス11を繰り返します追加プラスミド (例えば、蛍光レポーターのプラスミッド) を変換する、有能なセル11,を作成する必要がある場合,必要に応じて追加のプラスミッドのため12 。注: 場合エレクトロポレーション8を使用して、それは複数のプラスミド (pDawn Ag43 を含む) 同時に cotransform することが可能ただし、同時変換は推奨されません化学変換メソッドを使用して pDawn Ag43 の大きいサイズ (> 10 kB) の変換効率を削減手段として。 2. 照明細菌のプロジェクターの光のセットアップの準備 ケーブル、フィッティング、細菌の定温器内部の機能ことができる携帯用のプロジェクターを渡すため非透明な壁と穴細菌インキュベーターを取得し、プレゼンテーション投影 (のテーブルを参照ソフトウェア搭載ノート パソコン材料)。プロジェクターとインキュベーターを選ぶときは、プロジェクターの最小限の焦点距離がインキュベーターの室内高さ未満を確認します。 上昇、バイオ フィルム培養室がある天井に接続されている (図 2) 直接絞り指摘で、下部にインキュベーター内プロジェクターを配置します。 修正と光のブレッド ボード基本セットアップを構築することによって場所にプロジェクターが垂直の柱に接続されている順番に接続されている水平ポストにいるネジをプロジェクター (図 2)。プロジェクター/利用可能なパーツによって、この設定を変更できることに注意してください。最終的には、重要な要件は、上向き絞りでプロジェクターをしっかりと固定、インキュベーターの下部です。 インキュベーター内プロジェクター、ノート パソコンを介してディスプレイ ケーブル (例えばHDMI) に接続します。 場合表面-特に天井-インキュベーターの内部が反射 (例えば、金属研磨面)、反射を最小限に抑えるための暗いマット表面でそれらをカバーします。 インキュベーターの天井に空 ‘ダミー’ ディッシュをアタッチするのにには、テープを使用します。なお、プロジェクターに培養皿; をアタッチする複数の許容可能な方法があるので照明が発生した培養室の透明な底面がなく覆われているを確認します。 焦点の平面がインキュベーター (図 2) の天井に接続されているバイオ フィルム培養皿を (例えば、ウェル プレート) の下面と一致しているので、中心のノブを回して、プロジェクターの焦点を調整します。プロジェクターは、培養皿の底に鋭い、非ぼやけたイメージを照らす必要があります。削除 ‘ダミー’ 培養皿の投影に最適化されています。 最大の青い照明と全視野を照らすプロジェクターを直接ノート パソコン ソフトウェアを使用して (例えばRGB = [0, 0, 255]) 完全青のスライドを提示することによって。 インキュベーター天井で光検出器ヘッドを配置し対応するパワーメータ校正波長 460 nm の強度を読んで光パワーメータを使用してプロジェクターの照度を測定します。接続、使用される特定の電源メーターの受光素子を校正の指示に従います。 周囲の光を減らす (例えば部屋のライトをオフに、光源から離れた場所にインキュベーター) 照明の強度の測定を行う前に可能な限り。 プロジェクター絞り設置調節可能な中性密度フィルターを使用して照度を調整します。青色光の投影領域の中心の照度が 50 μ W/cm2を読み取るまで、電力計で測定照度を調整するフィルターを回転させます。注: ソフトウェアの端に下青の RGB 値を使用してください。、照明の明るさを調整することが可能ですが、照らされた対の間システムの光のコントラストを最大化することの利点は青の RGB 値を最大化するにはフィルターを使用してください。暗い領域。 ノート パソコンでプレゼンテーション/プロジェクター ソフトウェアを使用して、任意のパターンを描画し、インキュベーター、プロジェクターを使用して天井にこれらのパターンを表示します。注: 最大の青い照明とバイオ フィルム形成領域を描画する (例えばRGB = [0, 0, 255])、ない照明非バイオ フィルム形成領域 (例えばRGB = [0, 0, 0])。 3. 養殖パターン バイオ フィルム 照明、前に、彼らは確実に照明 (図 3 a) の後半の急激な成長段階で誘導されるグリセロール冷凍庫ストックから始まって pDawn Ag43 細菌を準備します。 LB + スペック寒天にグリセロール ストックから pDawn Ag43 ひずみを連勝します。成長のコロニーを許可する一晩 (37 ° C)。注: 照明文化ステップまでここからセルは暗闇の中で可能な限り滞在を確保-アンビエント照明 (例えばsubdilution の) で短時間は許容されます。 PDawn Ag43 菌で LB 寒天培地プレートからコロニーを接種 + スープを仕様し、一晩固定相へ (~ 16 h の 37 ° C 〜 250 rpm での振動インキュベーター) 文化を育てます。 LB で縮尺の比率で文化を subdilute + スープの仕様 (例えば、新鮮な LB + スペックの 1 mL に一晩かけて培養の 1 μ L を追加)。 後半指数/初期固定相 (OD 〜 1.0、揺れのインキュベーターで 〜 6 h 〜 250 rpm、37 ° C) まで成長する subdiluted 文化を許可します。 成長する文化を待っている間と 1 x M63 塩、1 mM MgSO4、グルコース 0.2%、0.1% カザミノ酸、水で 50 μ g/mL スペクチノマイシン M63 メディアの準備 (構成部分が滅菌を確認)。 M63 培地 50 μ g/mL スペクチノマイシンと 1: 100 の比率で遅い指数段階の文化を subdilute します。バイオ培養皿に希釈を導入し、(例えば、ピペットのウェル プレートに希釈サンプル)。注: 使用されている培養皿に依存するこの 1: 100 subdilution に必要なボリューム (例えば6 もポリスチレンのウェル プレート [非–培養処理]、1 つのサンプルを使用して場合 M63 + 仕様、2 ml として文化の 20 μ L を追加すること必要になります、6 ウェル プレートの標準的なよくボリューム、〜 2 mL) です。 サンプルは、照明する準備が整いましたと皿の底の表面が透明である照明の下からプロジェクターで確保するインキュベーターの天井に培養皿をテープします。注: それはインキュベーターの天井が迷光を最小限に抑えるため、反射ではないことを確認することが重要です。浮遊照明も減らせる培養皿として黒壁板を使用して、これは厳密には必要ではありませんが、このような板を使用して、底面が透明を確認します。 インキュベーターの一夜 (37 ° C でない揺れで 16 h) の文化にバイオ フィルムを許可します。注一部のプロジェクターが高温で信頼性が低くなっています。場合場合は、低温 (例えば、30 ° C)、文化はインキュベーション時間は大腸菌の菌株によって増加する必要があります心に留めておきます。 4. イメージング バイオ フィルムのパターン バイオ フィルムのサンプルの一晩の成長後インキュベーターから培養皿を削除します。上記の液体培地における分散性の浮遊細菌と同様に、それに照らされたが、その下の表面に付着したバイオ フィルム形成細菌料理だろう 浮遊性細胞を培養皿を (例えば、優しくピペットで吸引によって) から液体媒体を取除くことによって破棄します。 リンス サンプル 2 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューション、PBS で軽くピペッティングして残りの浮遊性細胞 (図 3 b) を削除すると x の後に吸引します。 セルはタグ蛍光、蛍光顕微鏡13 (例えば、広視野13、3次元共焦点14等)を使用してサンプルを直接撮像します。注: 蛍光バイオ フィルムも保存できる自己強化マウント媒体を使用しています。バイオ フィルムのサンプルにメディアをマウントの一滴を適用を下に、任意の気泡をキャプチャしないように世話ガラス基板でそれをカバー、一晩前にイメージングを強化することができます。 使用細菌細胞が蛍光でタグ付けられていない場合は、イメージ作成前クリスタル バイオレット染色法15 (図 3 b) バイオ フィルム コントラストを高めるためを適用します。 5. プロトコル変更/選択肢 さまざまな面に pDawn Ag43 細菌を育てます。 細菌サンプル/照明、添加前にウェル プレートにガラスやポリ ジメチル シロキサン (PDMS) クーポン (例えば、coverslips または PDMS の薄いストリップ) を入れて、ガラスのパターン pDawn ag43 バイオ フィルムに前とに、同じプロトコルに従うとPDMS。 透明、囲まれた培養室内 pDawn Ag43 細菌を育てます。 PDMS の文化商工会議所金型を生成します。 基本的な文化室ハード、長方形のプリズムを平らな面 (プリズムは金型は一度培養室として機能する PDMS の空洞になります) にアタッチすることにより金型を生成します。ソフト ・ リソグラフィー16を使用してより複雑な文化商工会議所金型を作製できることに注意してください。 PDMS を金型に注ぐと、それを治すために PDMS キャビティをキャスト (詳細なソフト ・ リソグラフィー プロトコル ゼウスの科学教育データベース16を参照してください)。 硬化後任意の過剰の PDMS をトリム、キャビティ/文化室に入口/出口チャネルをパンチし、表面間の空洞を残して平らな表面に PDMS をしっかりと押すことによって (例えばガラス/ポリスチレン) 平らな表面にキャビティを接着し、バイオ培養室として PDMS 天井。メモ: プラズマ治療16に基づいてより恒久的な接着も使えるがチップがない再利用できるし。 文化商工会議所/リンス PBS バッファー (図 3) に細菌のサンプルを導入する (ピペット) ではなく鈍い先端針と注射器を使用する前に、文化プロトコルに従ってください。 一時的に結合共振器を用いた、空洞が基になるガラス/ポリスチレン表面からアンボンドならないようにする、商工会議所の出入り口に液体をプルするだけ否定的な圧力を使用します。 PDawn Ag43 バクテリア フィルム フォトマスクを使用して構造化照明用。 映画フォトマスク プリンター/印刷サービスと互換性のある CAD ソフトウェアを使用してバイオ フィルム パターンを設計します。フォトマスク フィルム デザインは、バイオ フィルムは印刷するつもりの地域ではっきりとブラック/不透明を他の場所でする必要があります。完了したら、フォトマスク ファイルをプリンター/印刷サービスに送信し、物理的なフォトマスクの戻りを待ちます。 最大の青い照明と全視野を照らすプロジェクターを指示する (例えばRGB = [0, 0, 255]) ノート パソコンのソフトウェアを使用して。 大きいフィルム フォトマスクや夜間照明 (図 3 D) の細菌のサンプルを導入する前に皿バイオ フィルム文化の底に直接テープからの関心の領域を切り取ります。バイオ フィルムを前に文化、イメージ作成前培養後、フォトマスクを取り外します。