Nous démontrons un procédé de déposition biofilms bactériens d’Escherichia coli dans les patrons spatiaux arbitraires avec une haute résolution utilisant la stimulation optique d’une structure de surface-adhérence codée génétiquement.
Structuration et structure spatiale jouent un rôle important dans les biofilms bactériens. Nous démontrons une méthode accessible pour la culture des biofilms d’e. coli dans des configurations spatiales arbitraires à haute résolution spatiale. La technique utilise une construction codé génétiquement optogenetic — pDawn-Ag43 — que les couples la formation de biofilm chez e. coli à la stimulation optique en lumière bleue. Nous détaillons le processus de transformation d’e. coli avec pDawn-Ag43, préparer le montage optique requis et le protocole pour la culture des biofilms à motifs à l’aide de bactéries pDawn-Ag43. Utilisant ce protocole, biofilms avec une résolution spatiale inférieure à 25 μm peut être modelés sur différentes surfaces et environnements, y compris les chambres fermées, sans nécessiter de microfabrication, installations de salle blanche ou traitement de surface préalable. La technique est commode et plus approprié pour une utilisation dans les applications qui étudier l’effet de la structure des biofilms, offrant un contrôle ajustable de structuration du biofilm. Plus largement, il a également des applications potentielles dans les biomatériaux et de l’éducation, bio-art.
Les biofilms sont attachés à la surface des communautés de microbes et sont connus pour leur accouplement solide structure-fonction. Géométrie spatiale et structuration des biofilms jouent un rôle important dans la fonction communautaire globale (et vice versa)1. La longueur de petite échelles impliquée dans la structure des biofilms — l’ordre de dizaines de microns2— faire un contrôle accordable et pratique du biofilm, répétition d’un problème difficile. Nous démontrons un protocole qui permet d’être précisément à motifs en géométries arbitraires, fondées sur l’illumination optique des biofilms.
Le protocole présenté ici utilise pDawn-Ag433, une construction d’optogenetic qui allie la formation de biofilm dans la bactérie e. coli à l’illumination optique par la conduite de l’expression de Ag43 (un adhésine gène responsable de l’adhérence de surface et de biofilm formation) sous le contrôle de pDawn4 (un régulateur transcriptionnel contrôlé par illumination optique). La méthode est facile à utiliser et modèle biofilms sur différents environnements, y compris les chambres du Clos de la culture (transparent) de surface. Par rapport à des méthodes de dépôts cellule existantes, par exemple, axée sur les gouttelettes de dépôts5 ou surface prepatterning/traitement6, pDawn-Ag43 ne nécessite pas d’installations de microfabrication ou salle blanche et ne nécessite pas de matières autres que celles disponible à un laboratoire de microbiologie typique. Il est capable de modèle avec une résolution spatiale inférieure à 25 μm, approchant les dimensions spatiales de microcolonies naturellement des biofilms2. Dans l’ensemble, cette technique offre la possibilité de manipuler la structure des biofilms, qui puis ouvre de nombreuses pistes pour l’étude des microecology dans les communautés bactériennes7. En outre, biofilms à motifs peuvent fournir une plate-forme pratique sur lequel à l’ingénieur biomatériaux utile8,9. Dans cet article, nous examiner le protocole de base nécessaire à la structuration des biofilms en utilisant pDawn-Ag43 et de traiter les éventuelles modifications et dépannage liés à la méthode.
Compte tenu de la nécessité d’outils de recherche qui permettent pour le contrôle de structure de biofilm, nous avons présenté un protocole facile à utiliser pour les biofilms bactériens à l’aide de la construction d’optogenetic de pDawn-Ag43 le patterning. Avec cette technique, les biofilms d’e. coli peuvent être optiquement calquées sur divers environnements de surface, y compris des chambres fermées, avec une résolution spatiale inférieure à 25 μm.
Dans l’ensemble, ce protocole peut être décomposé en quatre sections principales : (1) la préparation de la bactérie pDawn-Ag43, (2) la préparation de l’optique et matériel de mise en place de la culture, (3) les étapes de l’illumination avant la croissance bactérienne et (4) l’illumination après rinçages et imagerie.
La partie critique de la section 1 est la réussite de la transformation du plasmide pDawn-Ag43 dans la souche e. coli d’intérêt. Cette opération est facilitée en isolant de haute qualité plasmide purifié et générant des cellules capables de haute qualité pour la transformation (tableau 1, dépannage).
La partie critique de l’article 2 est l’optimisation de l’installation du projecteur afin que l’intensité de l’éclairage est ajustée à 50 μW/cm2 à la longueur d’onde de 460 nm, et le projecteur est correctement centré à la hauteur d’exemple de biofilm. Notez que dans ce protocole, nous décrivons une installation d’éclairage inversé où le projecteur diffuse de la lumière par le bas, vers le haut vers l’exemple de biofilm. L’avantage de cette configuration est que la lumière n’a besoin que de voyager à travers le fond de la boîte de Pétri avant d’atteindre la surface de la formation de biofilm. Illumination par dessus signifie que la lumière devait se déplacer à travers les médias de liquides au-dessus de la surface du biofilm, qui, au cours de la croissance, se trouble avec les cellules planctoniques. Outre ces préoccupations, il est aussi important de minimiser les reflets dans la configuration optique autant que possible, par exemple, en dissimulant des surfaces réfléchissantes à l’intérieur de l’incubateur, ce qui permet d’obtenir des biofilms à motifs plus nettes. Une note liée, plus nette biofilm modèles peuvent également être obtenus en utilisant un photomasque pour contrôler la structuration de l’illumination (Figure 3D, Figure 4). Questions d’intérêt communes nécessitant le dépannage comprennent les problèmes de fiabilité de projecteur à des températures plus élevées (p. ex., 37 ° C), qui peuvent être minimisées en incubant la croissance de biofilm à des températures plus basses (par exemple, 30 ° C), ainsi que de logiciels qui provoque des mises à jour du système d’exploitation ou la lumière bleue de filtrage au cours de la croissance durant la nuit (tableau 1). Il est également important de noter que, selon le modèle de projecteur et incubateur utilisé, il est également possible que la chaleur générée par le projecteur se traduira par une température intérieure plus élevée que l’incubateur REGLAGE de temperature qui peut doivent être corrigées.
La partie critique de l’article 3 est l’obtention des échantillons bactériens fiables et répétables avant ils sont induits par l’illumination. Pour cette raison, il est recommandé d’obtenir des colonies de clones de bactéries pDawn-Ag43 par les rayures sur un plat d’agar et puis en suivant les étapes de culture liquide pour que les bactéries soient allumé/induite à la dernière phase de croissance exponentielle dans un répétable manière.
Enfin, la partie critique de l’article 4 est bien, mais aussi doucement, ronger les cellules planctoniques qui reste après le biofilm patterning protocole ; ainsi, il est recommandé d’effectuer plusieurs étapes de rinçage doux avec du PBS.
Par rapport aux techniques existantes pour cellule structuration5,6, biofilm optique basée sur pDawn-Ag43 le patterning a une assez faible barrière d’entrée à utiliser, car il ne nécessite pas de microfabrication, installations de salle blanche, complexe chimie, ou prétraitement de surface encore est encore capable de modèle avec la haute résolution (25 μm) généralement associée à des techniques de microfabrication. La méthode s’étend des travaux antérieurs sur la photolithographie bactérienne pour contrôler l’ expression de gène17. Actuellement, pDawn-Ag43 plasmide est limitée à e. coli, comme il utilise une origine pUC-basée de réplication, mais pDawn et Ag43 sont tous deux compatibles chez d’autres espèces de bactéries (Gram négatif). Techniques génétiques sont disponibles pour introduire éventuellement la formation de biofilm lumière régulée à différentes espèces bactériennes et représente une orientation possible pour de futures recherches. Une autre limitation potentielle de la technique, c’est qu’il agit en augmentant la formation de biofilm chez les souches avec la formation de biofilm native faible (p. ex., MG1655 e. coli). Cependant, souches avec la formation de biofilm indigène forte ont forme biofilms indépendamment des conditions d’éclairement, empêchant la formation de biofilm à motifs à l’aide de pDawn-Ag43 tel que décrit ici ; encore optogenetic techniques peuvent encore s’avérer applicables dans la régulation de la formation de biofilm. Nous notons que dans d’autres contextes, les méthodes alternatives de structuration de biofilm peuvent être disponibles, par exemple via la modulation optique de c-di-GMP18.
Dans l’ensemble, pDawn-Ag43 basé structuration sera appropriée pour une utilisation dans les applications qui étudier l’effet de la structure des biofilms sur fonction1 et, par conséquent, pourraient bénéficier de contrôle accordable sur biofilm structuration — un particulièrement pertinent exemple pour mettre en évidence est l’étude de l’écologie microbienne dans les biofilms2. Orientations futures comprennent des biomatériaux à motifs8,9 et/ou des communautés bactériennes structurées. Autres applications du présent protocole accessible également incluent bio-art19, étant donné le potentiel esthétique évident, mais aussi des sciences formelles et informelles de la vie education20,21,22. Du point de vue éducatif, le protocole décrit ici combine plusieurs techniques pertinentes (culture bactérienne, transformation, optique/optogenetics) et est également modulaire extensible (par exemple, inclure la microfluidique).
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient verre D., H. Kim, l’ACEI N., A. Combes, S. Rajan et B. clés pour leurs suggestions utiles et le laboratoire de Spormann pour accéder à leur microscope confocal. En outre, les auteurs reconnaissent l’appui de Stanford Bio-X Bowes et NSERC PGS bourses, le National Institute of Health (R21-AI-139941) et l’American Cancer Society (RSG-14-177-01).
DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center – Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture |
Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |