عالي الاستبانة "منقوشة استخدام الترسيب بيوفيلم" بدون-Ag43
Summary
علينا أن نظهر أسلوباً لإيداع الإشريكيّة القولونية الجرثومي الأغشية الحيوية في الأنماط المكانية التعسفي بدقة عالية باستخدام التحفيز البصري لبناء السطح-التصاق وراثيا المرمزة.
Abstract
الهيكل المكاني والزخرفة تلعب دوراً هاما في الأغشية الحيوية البكتيرية. هنا علينا أن نظهر أسلوب موجوداً لاستزراع الأغشية الحيوية كولاي إلى الأنماط المكانية التعسفي في عالية الدقة المكانية. يستخدم الأسلوب بناء أوبتوجينيتيك مشفرة جينياً-بدون-Ag43 — أن الأزواج تشكيل بيوفيلم في كولاي إلى تحفيز الضوئية بالضوء الأزرق. ونحن بالتفصيل عملية تحويل كولاي مع بدون-Ag43، إعداد البنية البصرية المطلوبة، والبروتوكول لاستزراع الأغشية الحيوية منقوشة باستخدام البكتيريا بدون-Ag43. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن منقوشة الأغشية الحيوية مع قرار مكانية أدناه 25 ميكرومترات على مختلف الأسطح والبيئات، بما في ذلك الدوائر المغلقة، دون الحاجة إلى ميكروفابريكيشن، ومرافق غرفة نظيفة، أو المعالجة السطحية. التقنية ملائمة ومناسبة للاستخدام في التطبيقات التي التحقيق أثر هيكل بيوفيلم، وتوفير رقابة الانضباطي على الزخرفة بيوفيلم. على نطاق أوسع، كما أن التطبيقات المحتملة في الحيوية والتعليم والفن الحيوي.
Introduction
الأغشية الحيوية المرفقة بسطح المجتمعات للميكروبات، وهي معروفة جيدا لاقتران وظيفة بنية قوية على. الهندسة المكانية والزخرفة للأغشية الحيوية تقوم دور هام في وظيفة المجتمع الشامل (والعكس بالعكس)1. طول الصغيرة جداول المشاركة في هيكل بيوفيلم – بناء على أمر من عشرات ميكرون2– جعل التحكم الانضباطي ومريحة من بيوفيلم الزخرفة مشكلة صعبة. هنا ندلل على بروتوكول يسمح للأغشية الحيوية أن يكون التحديد منقوشة في هندستها التعسفي، استناداً إلى الإضاءة الضوئية.
يستخدم البروتوكول المعروضة هنا بدون-Ag433، بناء أوبتوجينيتيك أن الأزواج تشكيل بيوفيلم في بكتيريا كولاي الإضاءة الضوئية بقيادة التعبير عن Ag43 (أدهيسين جينات مسؤولة عن التصاق السطحية وبيوفيلم تشكيل) تحت السيطرة لبدون4 (منظم النسخي يسيطر عليها الإضاءة الضوئية). الطريقة ملائمة للاستخدام ويمكن السطحي نمط الأغشية الحيوية على مختلف البيئات، بما في ذلك الدوائر المغلقة الثقافة (شفاف). مقارنة مع طرق الترسيب الخلية الموجودة، مثل ترسب المستندة إلى الحبرية5 أو سطح بريباتيرنينج/العلاج6، لا تتطلب مرافق غرفة نظيفة أو ميكروفابريكيشن بدأون-Ag43 ولا تتطلب مواد تتجاوز تلك المتاحة لمختبر الميكروبيولوجيا نموذجية. وقادر على نمط مع قرار مكانية أدناه 25 ميكرومتر، تقترب بالأبعاد المكانية ميكروكولونيس في القائمة بطبيعة الحال الأغشية الحيوية2. وعموما، هذا الأسلوب يوفر القدرة على التعامل مع هيكل بيوفيلم، ثم يفتح طرقاً عديدة لدراسة ميكروكولوجي في المجتمعات البكتيرية7. بالإضافة إلى ذلك، قد توفر الأغشية الحيوية منقوشة منصة ملائمة لمهندس الحيوية مفيدة8،9. في هذه الورقة، ونحن مناقشة البروتوكول الأساسية المطلوبة للزخرفة الأغشية الحيوية باستخدام بدون-Ag43 ومعالجة التعديلات المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها المتعلقة بالأسلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي ضوء الحاجة إلى أدوات البحث التي تسمح بتحكم بنية بيوفيلم، قدمنا بروتوكولا سهلة الاستخدام للزخرفة الأغشية الحيوية البكتيرية التي تستخدم في بناء أوبتوجينيتيك بدون-Ag43. مع هذه التقنية، يمكن منقوشة الأغشية الحيوية كولاي بصريا في مختلف البيئات السطحية، بما في ذلك الدوائر المغلقة، مع قرار مكانية أدناه 25 ميكرومتر.
وإجمالا، يمكن تقسيم هذا البروتوكول إلى أربعة أقسام رئيسية: (1) إعداد البكتيريا بدون-Ag43، (2) إعداد البصرية والثقافة إنشاء الأجهزة وخطوات النمو البكتيري قبل الإضاءة (3) الإضاءة (4) بعد انتهاء يشطف والتصوير.
الجزء الحاسم من القسم 1 هو نجاح تحويل بلازميد بدون-Ag43 إلى سلالة كولاي من الفائدة. وهذا يسر بعزل بلازميد النقية عالية الجودة وتوليد الخلايا المختصة عالية الجودة للتحول (الجدول 1، استكشاف الأخطاء وإصلاحها).
جزءا حاسما من القسم 2 هو الأمثل لتركيب جهاز الإسقاط حتى يتم ضبط شدة الإضاءة إلى 50 μW/سم2 في الطول الموجي نانومتر 460، وجهاز الإسقاط ويتركز بشكل صحيح في ذروة عينة بيوفيلم. ملاحظة أن في هذا البروتوكول، يصف لنا إنشاء إضاءة مقلوب حيث البروجيكتور يضيء الضوء من أسفل إلى أعلى، واتجاه العينة بيوفيلم. وميزة هذا التشكيل أن الضوء يحتاج إلى السفر عبر الجزء السفلي من الطبق الثقافة قبل الوصول إلى سطح تشكيل بيوفيلم فقط. الإضاءة من فوق يعني أنه سيتعين على ضوء السفر عبر وسائل الإعلام السائلة فوق سطح بيوفيلم، الذي، خلال مسار النمو، يحصل غائم مع خلايا العوالق. وبالإضافة إلى هذه الشواغل، من المهم أيضا تقليل ضوء شارد في التشكيل البصري، قدر الإمكان، على سبيل المثال، بالتستر على الأسطح العاكسة في المناطق داخلية الحضانة – وهذا يساعد على الحصول على أدق الأغشية الحيوية منقوشة. وفي هذا الصدد، يمكن الحصول أكثر وضوحاً بيوفيلم أنماط أيضا باستخدام النبائط للتحكم في الإضاءة الزخرفة (3D الشكل، الشكل 4). تشمل القضايا المشتركة التي تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها مشكلات الوثوقية الإسقاط في درجات حرارة أعلى (مثلاً، 37 درجة مئوية)، الذي يمكن التقليل بحضانة نمو بيوفيلم عند درجات حرارة منخفضة (مثلاً، 30 درجة مئوية)، فضلا عن برامج الكمبيوتر التي يتسبب تحديثات نظام التشغيل أو الضوء الأزرق التصفية خلال النمو بين عشية وضحاها (الجدول 1). من المهم أيضا أن نلاحظ أنه، اعتماداً على نموذج الإسقاط وحاضنة المستخدمة، من الممكن أيضا أن الحرارة المتولدة من البروجيكتور سيؤدي إلى درجة حرارة داخلية أعلى من الحاضنة ضبط درجة الحرارة، والتي قد تحتاج إلى تصحيح.
جزءا حاسما من القسم 3 هو الحصول على العينات البكتيرية يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتكرار قبل الناجم عن الإضاءة. ولهذا السبب، من المستحسن للحصول على مستعمرات الاستنساخ من البكتيريا Ag43 بدون streaking بها على صفيحة أجار وثم استخدام الخطوات ثقافة السائل لضمان أن البكتيريا مضيئة المستحث في أواخر المرحلة النمو الأسى في التكرار طريقة.
أخيرا، جزء أساسي من القسم 4 جيدا، ولكن أيضا بلطف، يغسل العوالق الخلايا المتبقية بعد بيوفيلم الزخرفة البروتوكول؛ وهكذا، من المستحسن القيام بالعديد من الخطوات شطف لطيف مع برنامج تلفزيوني.
مقارنة بالتقنيات الموجودة للخلية الزخرفة5،6، بيوفيلم الضوئية الزخرفة بدون-Ag43 على أساس ما حاجز منخفض معقول من الدخول لاستخدام، حيث أنها لا تتطلب ميكروفابريكيشن، مرافق غرفة نظيفة، ومجمع الكيمياء، أو المعالجة السطحية، حتى الآن لا تزال قادرة على نمط بدقة عالية (25 ميكرومتر) المرتبطة عادة بتقنيات ميكروفابريكيشن. ويمتد الأسلوب العمل السابقة بشأن التصويرية البكتيرية للتحكم في التعبير الجيني17. حاليا، Ag43 بدون بلازميد يقتصر على كولاي، كما أنه يستخدم مصدر pUC المستندة للنسخ المتماثل، ولكن بدون و Ag43 كلاهما متوافق في سائر أنواع الجراثيم (سلبية الغرام). التقنيات الوراثية متاحة لاحتمال إدخال تشكيل بيوفيلم ينظم الضوء على مختلف أنواع الجراثيم، ويمثل اتجاه ممكن للبحوث في المستقبل. آخر الحد المحتملة لهذه التقنية أنه يعمل عن طريق زيادة تكوين بيوفيلم في سلالات مع تشكيل بيوفيلم الأصلية ضعيفة (مثلاً، MG1655 كولاي). ومع ذلك، يكون سلالات مع تشكيل بيوفيلم أصلية قوية شكل الأغشية الحيوية بغض النظر عن ظروف الإضاءة، ويحول دون تشكيل بيوفيلم منقوشة باستخدام بدأون-Ag43 كما هو موضح هنا؛ حتى الآن قد لا يزال يثبت تقنيات أوبتوجينيتيك المطبقة في تنظيم تشكيل بيوفيلم. ونلاحظ أنه في سياقات أخرى، قد تكون أساليب بديلة للزخرفة بيوفيلم المتاحة، مثل عن طريق بصري ج-دي-GMP التحوير18.
عموما، سوف تكون الزخرفة بدون-Ag43 على أساس مناسب للاستخدام في التطبيقات التي التحقيق أثر هيكل بيوفيلم على وظيفة1 ، وعليه، يمكن أن تستفيد من التحكم الانضباطي الزخرفة بيوفيلم-ذات أهمية خاصة مثال لتسليط الضوء على دراسة الإيكولوجيا الميكروبية في الأغشية الحيوية2. وتشمل التوجهات المستقبلية مما يجعل الحيوية منقوشة8،9 و/أو المجتمعات البكتيرية منظم. وتشمل التطبيقات البديلة لهذا البروتوكول موجوداً أيضا بيو-الفن19، نظراً لإمكانات جمالية واضحة، فضلا عن علوم الحياة الرسمية والتعليم20،،من2122. من منظور التربية، البروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين العديد من التقنيات ذات الصلة (ثقافة البكتيرية، التحول، والبصريات/أوبتوجينيتيكس) وهي أيضا قابلة للتمديد مجزأة (مثلاً، تشمل ميكروفلويديكس).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الزجاج دال وحاء – كيم وعم أ.، تشوكسى أ، راجان س. ومفاتيح باء لتلك الاقتراحات المفيدة ومختبر سبورمان للوصول إلى المجهر [كنفوكل]. وعلاوة على ذلك، تقر الكتاب الدعم المقدم من جامعة ستانفورد بيو-X باوز ومقدمة سرفيسز الزمالات، المعهد الوطني للصحة (R21-منظمة العفو الدولية-139941)، وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-14-177-01).
Materials
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center – Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial Biofilms. Annual Review of Microbiology. 49 (1), 711-745 (1995).
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O’Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2010).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. . Signs of Life: Bio Art and Beyond. , (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7 (2013).
