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Bioengineering

Hochauflösende gemustert Biofilm Abscheidung mittels pDawn-Ag43

Published: October 23, 2018
doi:
10.3791/58625
,
1Department of Bioengineering,Stanford University

Summary

Wir zeigen eine Methode für die Hinterlegung von Escherichia coli bakterielle Biofilme in beliebige räumliche Muster mit hoher Auflösung verwenden optische Stimulation eines genetisch codierten Oberfläche Kraftschlußbeiwert Konstrukts.

Abstract

Räumliche Struktur und Musterung spielen eine wichtige Rolle in bakteriellen Biofilmen. Hier zeigen wir eine zugängliche Methode zur Kultivierung von E. Coli Biofilme in beliebige räumliche Muster mit hoher räumlicher Auflösung. Die Technik nutzt ein genetisch codierten optogenetische Konstrukt — pDawn-Ag43-Paare, die Biofilmbildung in E. Coli , optische Stimulation durch blaues Licht. Wir ausführlich den Prozess zur Transformation von E. Coli mit pDawn-Ag43, Vorbereitung der erforderlichen optischen Aufbau und das Protokoll für die Kultivierung von gemusterten Biofilme mit pDawn-Ag43 Bakterien. Unter Verwendung dieses Protokolls, können Biofilme mit einer räumlichen Auflösung unter 25 μm auf verschiedenen Oberflächen und Umgebungen, einschließlich geschlossene Kammern ohne Microfabrication, Reinraum-Einrichtungen oder Oberflächenvorbehandlung angeordnet werden. Die Technik ist praktisch und geeignet für den Einsatz in Anwendungen, die die Wirkung der Biofilm-Struktur, die abstimmbaren Kontrolle über Biofilm Musterung zu untersuchen. Darüber hinaus hat es auch Einsatzmöglichkeiten in Biomaterialien, Bildung und Bio-Kunst.

Introduction

Biofilme sind Oberfläche befestigt Gemeinschaften von Mikroben und sind bekannt für ihre starke Struktur-Funktions-Kupplung. Raumgeometrie und Strukturierung von Biofilmen spielen eine wichtige Rolle im gesamten Community-Funktion (und umgekehrt)1. Die kleinen Länge Skalen Biofilm Struktur beteiligt – in der Größenordnung von 10 µm2— abstimmbaren und bequeme Kontrolle der Biofilm Musterung eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein Protokoll, das für Biofilme zu genau gemustert in beliebigen Geometrien, basierend auf optischen Beleuchtung ermöglicht.

Die hier vorgestellten Protokoll verwendet pDawn-Ag433, ein optogenetische Konstrukt, die Biofilmbildung in E. Coli -Bakterien, optische Ausleuchtung Paare durch die Expression von Ag43 fahren (eine adhäsin gen für die Oberflächenhaftung und Biofilm Bildung) unter der Kontrolle der pDawn4 (ein transcriptional Regler gesteuert durch optische Ausleuchtung). Die Methode ist bequem zu bedienen und können Muster Biofilme in verschiedenen Umgebungen, einschließlich geschlossenen (transparent) Kultur Kammern Oberfläche. Im Vergleich zu bestehenden Zelle Ablagerung Methoden, z. B. Tröpfchen-basierte Abscheidung5 oder Oberfläche Prepatterning/Behandlung6, pDawn-Ag43 erfordert keine Microfabrication oder Reinraum-Einrichtungen und erfordert keine Materialien hinausgehen eine typische Mikrobiologie-Labor zur Verfügung. Es ist in der Lage, mit einer räumlichen Auflösung unter 25 μm, nähert sich die Raumdimensionen mikrokolonien in natürlich vorhandenen Muster Biofilme2. Insgesamt bietet diese Technik die Möglichkeit, Biofilm Struktur, zu manipulieren, was dann viele Wege öffnet, um Microecology bakteriengemeinschaften7zu studieren. Gemusterte Biofilmen können darüber hinaus eine komfortable Plattform zur nützlich Biomaterialien8,9Ingenieur vorsehen. In diesem Papier wir besprechen das grundlegende Protokoll für Musterung Biofilme mit pDawn-Ag43 erforderlich und Adresse möglicher Modifikationen und Fehlerbehebung im Zusammenhang mit der Methode.

Protocol

1. Vorbereitung des pDawn-Ag43 Bakterienstämme Verwandeln Sie pDawn-Ag43 in einem E. Coli -Stamm von Interesse (Abbildung 1). Wachsen Sie einen Klonen Stamm hosting pDawn-Ag43 Plasmid (erhältlich von einem Plasmid-Repository) durch impfen die Dehnung in LB-Brühe mit 50 μg/mL Spectinomycin (LB + Spec) in einem Kultur-Rohr (über Nacht in ein schütteln Inkubator bei ~ 250 u/min, 37 ° C) ergänzt. Verwenden Sie dann eine Miniprep Kit, um gereinigtes pDawn-Ag43 Plasmid10zu ernten. Wählen Sie ein E. Coli -Stamm von Interesse für angeordnet werden. Bisher wurde pDawn-Ag43 bestätigt, in MG16553 und BW25113 zu arbeiten. Eine etabliertes Protokoll verwenden, um kompetent zu generieren (z.B., chemisch kompetente11 oder Electrocompetent12) Aktien des gewählten E. Coli -Stamm (z.B.MG1655). Verwandeln Sie pDawn-Ag43 Plasmid in die zuständigen Bakterien11,12, gefolgt von 1 h Erholung und Platte auf LB + Spec Agarplatten. Lassen Sie Kolonien, über Nacht bei 37 ° c zu wachsen Shop pDawn-Ag43 verwandelt Stämme. Eine einzige Kolonie von pDawn-Ag43 aus einer LB impfen + spec nährbodenplatte in LB + spec Brühe in einem Kultur-Rohr und wachsen sie in einem schütteln Inkubator (bei ~ 250 u/min, 37 ° C), exponentielle Phase (OD600 ~0.4 – 0,8). Bereiten Sie Lager die pDawn-Ag43 verwandelt Belastung bei-80 ° C langfristige Speichern durch das Mischen von 1 mL der Kultur mit 1 mL 50 % steriles Glyzerin in einem Cryo-Röhrchen zu einer 25 % Glycerin Gefrierschrank Lager vor. Speichern Sie diese in einem-80 ° C Gefrierschrank. Zusätzliche Plasmide (z.B. fluoreszierende Reporter Plasmide) umgewandelt werden, erstellen Sie kompetente Zellen11,12 aus der pDawn-Ag43 Belastung transformiert und wiederholen die Umwandlung Prozeß11 , 12 für zusätzliche Plasmide je nach Bedarf.Hinweis: Wenn Elektroporation8verwenden, ist es möglich, mehrere Plasmide (einschließlich pDawn-Ag43) gleichzeitig cotransform; eine gleichzeitige Transformation wird jedoch nicht empfohlen chemische Umwandlung Methoden, wie die Größe (> 10 kB) der pDawn-Ag43 bedeutet, dass Transformation Effizienz reduziert werden. 2. Vorbereitung des optischen Aufbaus Projektor für leuchtende Bakterien Erhalten einen bakterielle Inkubator mit undurchsichtigen Wänden und ein Loch für das Kabel, einen tragbaren Projektor in der Lage, Montage und Funktion in die bakterielle brutmaschine bestehen und ein Laptop mit Software für die Präsentation-Projektion (siehe Tabelle des ausgestattet Materialien). Bei der Wahl des Projektors und der Inkubator stellen Sie sicher, dass die minimale Brennweite des Projektors ist kleiner als die innere Höhe des Inkubators. Stellen Sie den Projektor in die brutmaschine an der Unterseite, mit der Blende zeigt direkt nach oben, an der Decke, wo befindet sich die Biofilm-Kultur-Kammer (Abbildung 2) befestigt. Update der Projektor im Ort durch den Bau einer Einrichtung mit einer optischen Steckbrett Basis mit einer vertikalen Pfosten verbunden verbunden wiederum zu einem horizontalen Beitrag die Schrauben in den Projektor (Abbildung 2). Beachten Sie, dass dieses Set-up je nach der Projektor/verfügbaren Teile modifiziert werden kann. Letztlich ist die wichtigste Voraussetzung, dass der Projektor im unteren Bereich des Inkubators, mit der Öffnung nach oben fest fixiert ist. Verbinden Sie den Laptop über das Display-Kabel (z. B.HDMI) an den Projektor in die brutmaschine. Wenn die Oberflächen – vor allem die Decke — das Innere des Inkubators sind reflektierende (z. B.polierter Metalloberfläche), decken Sie sie mit dunklen matten Oberflächen, Reflexionen zu minimieren. Eine leere “dummy” Kulturschale an der Decke des Inkubators befestigen Sie mit Klebeband. Beachten Sie, dass, wie bei den Projektor gibt es mehrere akzeptable Möglichkeiten, eine Kulturschale befestigen; sicherstellen Sie, dass die transparente Bodenfläche der Kultur Kammer, wo Beleuchtung auftritt, nicht abgedeckt ist. Stellen Sie den Fokus auf den Projektor durch Drehen der fokussierknopf, so dass der Fokusebene deckt sich mit der unteren Fläche der Biofilm-Kulturschale (z. B.ein well-Platte) an der Decke des Inkubators (Abbildung 2) angebracht. Der Projektor sollte eine scharfe, nicht verschwommene Bild auf den Boden der Kulturschale beleuchten. Der “dummy” Kulturschale zu entfernen, sobald die Projektion optimiert wurde. Mit Laptop-Software, direkt den Projektor, volle Sehfeld mit maximalen blaue Beleuchtung zu beleuchten (z.B.RGB = [0, 0, 255]) durch die Vorlage einer vollständigen blauen Folie. Messen Sie die Beleuchtungsintensität des Projektors mit einem optische Leistungsmesser indem Photodetektor Kopf an der Decke Inkubator und lesen die Intensität auf die entsprechenden Leistungsmesser auf Licht-Wellenlänge 460 nm kalibriert. Folgen Sie den Anweisungen zur Verbindungsherstellung und Kalibrierung der Photodetektor für das spezielle Power-Meter verwendet. Umgebungslicht zu reduzieren (z. B.Raumbeleuchtung ausschalten, oder legen Sie den Inkubator von Lichtquellen) so weit wie möglich vor der Beleuchtung Intensität Messungen. Passen Sie die Beleuchtungsintensität verwenden ein verstellbarer Graufilter am Projektor Blende an. Drehen Sie den Filter anpassen die Beleuchtungsstärke, gemessen an den Leistungsmesser, bis die Beleuchtungsstärke in der Mitte der Blaulicht-projizierten Region 50 Wμ/cm2lautet.Hinweis: Es ist, zwar möglich, die Beleuchtungsintensität mit niedriger blau RGB-Werte am Ende Software anpassen mithilfe eines Filters, während blau RGB-Wert zu maximieren, den Vorteil hat der Maximierung des optischen Kontrast des Systems zwischen beleuchteten Vs. dunkle Regionen. Beliebige Muster, die mit der Präsentation/Projektor-Software auf dem Laptop zu ziehen und diese Muster auf der Decke des Inkubators, Verwendung des Projektors anzeigen.Hinweis: Biofilm bilden Regionen sollte mit maximaler blaue Beleuchtung gezogen werden (z.B.RGB = [0, 0, 255]), nicht-Biofilm-Bildung von Regionen mit keine Beleuchtung (z.B.RGB = [0, 0, 0]). (3) Kultivierung gemusterten Biofilme Bereiten Sie vor der Beleuchtung die pDawn-Ag43 Bakterien, ausgehend von dem Glycerin Gefrierschrank bestand, so dass sie zuverlässig bei der späten exponentiellen Wachstumsphase für Beleuchtung (Abbildung 3A) induziert werden. Durchziehen Sie einen pDawn-Ag43 Stamm aus Glycerin bestand auf LB + Spec Agarplatten. Kolonien wachsen lassen über Nacht (37 ° C).Hinweis: Von hier bis die Beleuchtung Kultur Schritt, sicher die Zellen bleiben im Dunkeln so viel wie möglich – kurze Zeiträume bei ambient Beleuchtung (z. B.für Subdilution) sind akzeptabel. Eine Kolonie von pDawn-Ag43 Bakterien aus einer nährbodenplatte in LB impfen + spec Brühe und wachsen die Kultur über Nacht zur stationären Phase (in einem schütteln Inkubator bei ~ 250 u/min, 37 ° C für ~ 16 h). Subdilute die Kultur in einem Verhältnis von 1:1,000 mit LB + spec Brühe (z.B.1 mL frisches LB + Spec 1 μL der Nacht Kultur hinzufügen). Lassen Sie die subdiluted Kultur bis späten exponentiellen/frühen stationären Phase (OD ~ 1.0, ~ 6 h in einem schütteln Inkubator bei ~ 250 u/min, 37 ° C) wachsen. Während des Wartens auf die Kultur wachsen, bereiten M63 Medien mit 1 x M63 Salze, 1 mM MgSO40,2 % Glukose, 0,1 % Casamino Säuren und Spectinomycin 50 μg/mL in Wasser (stellen Sie sicher, die Bestandteile sind steril). Subdilute der späten exponentiellen Phase-Kultur in einem Verhältnis von 1: 100 mit M63 Medien mit 50 μg/mL Spectinomycin ergänzt. Dann stellen die Verdünnung in der Kulturschale Biofilm (z. B.pipette der verdünnte Probe in einem well-Platte).Hinweis: Für dieses 1: 100 Subdilution erforderlichen Mengen hängen der Kulturschale verwendet wird (z. B., wenn eine Polystyrol 6-Well well-Platte [nicht-Gewebe-Kultur behandelt], ein einzelnes Sample verwenden müsste 2 mL M63 + Spec, 20 μL der Kultur hinzugefügt, als die Standard beträgt auch eine 6-Well-Platte ~ 2 mL). Da die Proben jetzt bereit für die Beleuchtung sind, Kleben der Kulturschale an der Decke des Inkubators, um sicherzustellen, dass die Oberfläche an der Unterseite des Tellers transparent für die Beleuchtung von unten vom Projektor ist.Hinweis: Es ist darauf zu achten, dass die Decke des Inkubators nicht reflektierend, streunenden Beleuchtung zu minimieren. Streunende Beleuchtung kann auch mit schwarzen Wänden Platten als Kultur-Gerichte, reduziert werden, obwohl dies nicht unbedingt erforderlich ist — wenn solche Platten verwenden, stellen Sie sicher die Bodenfläche ist transparent. Ermöglichen Sie die Biofilme zu Kultur in den Inkubator über Nacht (16 h mit kein schütteln bei 37 ° C). Beachten Sie, dass einige Projektoren bei höheren Temperaturen weniger zuverlässig geworden. Wenn das der Fall ist, halten Kultur bei niedrigeren Temperaturen (z.B.30 ° C), im Verstand, die die Inkubationszeit möglicherweise erhöht werden, abhängig von der E. Coli -Stamm. 4. Bildgebung gemustert Biofilme Nach der Übernachtung Wachstum der Biofilm Proben Entfernen der Kulturschale aus dem Inkubator. Das Gericht wird haben Biofilm Bakterien an seiner Unterseite angebracht wo es beleuchtet worden ist sowie planktonischen Bakterien in den oben genannten Flüssigmedien zerstreut. Verwerfen Sie die planktonischen Zellen indem die flüssigen Medien aus der Kulturschale (z. B.durch sanft Absaugen mit einer Pipette). Spülen Sie die Probe 2 X mit einer Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung, die verbleibenden planktonischen Zellen (Abb. 3 b) zu entfernen, indem sanft Pipettieren mit PBS-Puffer, gefolgt von Aspiration. Wenn die Zellen fluoreszent markiert sind, Bild direkt die Proben unter Verwendung Fluoreszenz-Mikroskopie-13 (z.B., Weitfeld-13, 3-d-konfokale14, etc.).Hinweis: Fluoreszierende Biofilme kann auch mit einem selbst Härten Eindeckmedium bewahrt werden. Tropfen Sie ein Montage Medien auf eine Stichprobe von Biofilm, bedecken Sie es mit einem Glas deckgläschen, kümmert sich nicht um alle Bläschen unter, zu erfassen und lassen Sie es vor der Bildgebung über Nacht aushärten lassen. Wenn die Bakterienzellen verwendet nicht fluoreszent markiert sind, gelten Sie die Kristallviolett Fleck Technik15 (Abb. 3 b), um Biofilm Kontrast zu verbessern vor Bildgebung. 5. Protokoll Modifikationen/Alternativen PDawn-Ag43 Bakterien auf verschiedenen Oberflächen zu wachsen. Well-Platten vor der Zugabe von einer bakteriellen Probe/Beleuchtung Glas oder Poly-Dimethyl-Siloxan (PDMS) Gutscheine (z.B., Deckgläsern oder dünne Streifen von PDMS) hineingesteckt, und folgen Sie das gleiche Protokoll wie zuvor nach Muster pDawn-ag43 Biofilmen auf Glas und PDMS. PDawn-Ag43 Bakterien in einem transparenten, geschlossene Kultur-Kammer zu wachsen. Generieren Sie eine Kultur Kammer Form für PDMS. Erzeugen Sie für eine grundlegende Kultur Kammer Schimmel durch das Anbringen eines harten, rechteckigen Prismas auf einer ebenen Fläche (das Prisma wird ein Hohlraum in der PDMS, die als Kultur-Kammer dient, sobald die Form umgewandelt wird). Beachten Sie, dass komplizierte Kultur Kammer Formen mit weichen Lithographie16gefertigt werden können. Werfen einen PDMS Hohlraum von PDMS in die Form gießen und ermöglicht es, zu heilen (für eine detaillierte weiche Lithographie-Protokoll, siehe Jupiters Science Education Database16). Nach dem Aushärten Trimmen alle überschüssigen PDMS, Punsch Einlass/Auslass-Kanäle in die Kavität/Kultur-Kammer und binden den Hohlraum auf einer ebenen Fläche (z.B. Glas/Polystyrol) durch fest drücken die PDMS auf die flache Oberfläche, so dass des Hohlraums zwischen der Oberfläche und der PDMS-Decke als Biofilm Kultur Kammer.Hinweis: Dauerhaftere Bindung basierend auf Plasma Behandlung16 kann auch verwendet werden, aber die Chips werden dann nicht wiederverwendbar. Folgen Sie der Kultur-Protokoll als vor, mit einer Spritze mit stumpfer Spitze Nadeln (anstelle einer Pipette) zur Einführung der bakteriellen Probe in der Kultur Kammer/Spülen mit PBS-Puffer (Abbildung 3). Wenn einen vorübergehend geklebten Hohlraum, verwenden Sie nur Unterdruck ziehen Flüssigkeit in der Kammer, um sicherzustellen, dass der Hohlraum nicht ungebundenen von der zugrunde liegenden Glas/Polystyrol-Oberfläche wird. Wachsen Sie pDawn-Ag43 Bakterien mit einer Fotomaske Film für strukturierte Beleuchtung. Entwerfen Sie eine Biofilm-Muster mit CAD-Software kompatibel mit einem Film Fotomaske Drucker/Print Service. Die Fotomaske Filmdesign sollte klar in Regionen, wo der Biofilm gedruckt werden soll, und schwarz/opak an anderer Stelle. Nach Abschluss dieses Vorgangs senden Sie die Fotomaske Datei an den Drucker/Druckservice und warten auf die Rückkehr von der physischen Fotomaske. Weisen Sie den Projektor ein volles Sehfeld mit maximalen blaue Beleuchtung beleuchten (z.B.RGB = [0, 0, 255]) mit Laptop-Software. Schneiden Sie eine Zielregion aus dem größeren Film Photomaske und Band es direkt an der Unterseite der Biofilm Kultur austeilen, vor der Einführung der bakteriellen Probe für die Nacht Beleuchtung (Abbildung 3D). Kultur der Biofilme wie zuvor, und entfernen Sie die Fotomaske nach Kultivierung vor Bildgebung.

Representative Results

Wie in Abbildung 4A, pDawn-Ag43 Bakterien wurden zur Erzeugung von Biofilmen in Polystyrol-well-Platten mit Projektor-Beleuchtung (der Projektor wurde eingerichtet, um eine Polka-Dot Muster zu beleuchten), gemustert abgebildet durch Brightfield Mikroskopie mit Kristall Violetter Fleck als Kontrastmittel und Fluoreszenz-Mikroskopie mit roten Leuchtstoff-Protein-exprimierenden Bakterien. Fluoreszierende Biofilm Proben können auch mithilfe der konfokalen Mikroskopie14 Aufnahmen des Biofilms in 3-d (Abbildung 4 b) abgebildet werden. In Abbildung 4zeigen wir die hochauflösende Musterung möglich mithilfe einer Fotomaske Film gemusterten Beleuchtung der Biofilm-Probe zur Verfügung stellen. Schließlich, in Abbildung 4 und 4E, zeigen wir Beispiele für Musterung auf Glas und PDMS Oberflächen sowie geschlossenen PDMS Kultur Kammern – zeigen die verschiedenen Arten von Umgebungen, wo pDawn-Ag43 Musterung angewendet werden kann. Abbildung 1: Vorbereitung der pDawn-Ag43 Bakterien (Protokoll Abschnitt 1). Vorbereitung pDawn-Ag43 Bakterien in der Lage, Licht-regulierten Biofilmbildung umfasst Reinigung pDawn-Ag43 Plasmid von einem Host Klonen Stamm, Umwandlung in ein E. Coli -Stamm von Interesse und Erstellen von bakteriellen Gefrierschrank Vorrat für langfristige Lagerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Vorbereitung einer optischen Aufbau Biofilm Probe Beleuchtung (Protokoll Abschnitt 2). Der optische Aufbau ist in einem bakteriellen brutmaschine untergebracht und besteht aus einem Computer verbunden Projektor beleuchtet eine Biofilm-Probe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Kultur-Protokoll für die Strukturierung von Biofilmen (Protokoll Abschnitt 3). (A) vor der Beleuchtung, pDawn-Ag43 Bakterien sind bereit vor der Musterung, so dass sie zuverlässig bei der richtigen Wachstumsphase induziert werden. (B) nach Übernachtung Wachstum beleuchtet, ein gemusterter Biofilm wird am unteren Rand der Kulturschale mit planktonischen Zellen in den flüssigen Medien anwesend sein und nach einigen weiteren Verarbeitung, der Biofilm ist bereit für die Bildgebung. (C) als Alternative zu Platten gut kann Biofilme in geschlossenen Kultur Kammern wie einen geformten PDMS Hohlraum gezüchtet werden. In diesem Fall können Spritzen befestigt, stumpfe Spitze Nadeln verwendet werden, zur Einführung der Probenmaterials und Flüssigkeiten aus der Kammer zu spülen. (D) als Alternative zur Projektor-basierte Beleuchtung Muster, Muster können auch durch Abkleben Film Photomasks direkt an der Unterseite der Biofilm Kultur Kammern erzeugt werden. In diesem Fall sollte der Projektor, blaues Licht über das gesamte Feld zu beleuchten eingerichtet werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse von Biofilmen gemustert mit pDawn-Ag43. Alle Ergebnisse wurden mit Hilfe einer MG1655 E. Coli -Host-Stamm. (A) pDawn-Ag43 Bakterien wurden zur Erzeugung von Biofilms gemustert in Polystyrol-well-Platten mit Projektor-Beleuchtung (der Projektor wurde eingerichtet, um eine Polka-Dot Muster zu beleuchten), abgebildet durch Brightfield Mikroskopie mit Kristallviolett Fleck als eine Kontrastmittel und Fluoreszenz-Mikroskopie mit roten Leuchtstoff-Protein-exprimierenden Bakterien. (B) fluoreszierende Biofilm Proben werden mit der konfokalen Mikroskopie, 3-d-Bilder des Biofilms zu erhalten abgebildet. (C) hochauflösende Biofilmen können mit einer Fotomaske Film, gemusterte Beleuchtung der Biofilm-Probe angeordnet werden. (D) Biofilme können auf Glas und PDMS Oberflächen angeordnet werden. (E) Biofilme können in geschlossenen Kultur Kammern angeordnet werden. Diese Zahl wurde von früheren Arbeiten3angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Problem Mögliche Ursachen/Lösungen Transformierung pDawn-Ag43 zu Host Stamm – keine Kolonien Niedrige Konzentration von Plasmid – Plasmid Konzentration auf Spektrometer zu überprüfen. Eine typische Miniprep pDawn-Ag43 sollte mindestens 100 ng/μl ergeben; bis zu 10-100 ng für Transformation verwenden Check/Remake kompetente Zellen: kompetente Zellen müssen transformationseffizienz mindestens 10 ^ 6 KBE/µg über ein standard Plasmid wie pUC19 – wenn nicht, Remake kompetente Zellen verifiziert Falsch (Niveau) Antibiotikum auf LB-Agar-Platte – achten Sie darauf, 50 μg/mL Spectinomycin zur Auswahl Projektor Beleuchtung macht aus / Widerspruch über Nacht Deaktivieren Sie die problematische Software wie z. B.: automatische Übernachtung Software/OS Updates, nächtliche Blaulicht-Filter Projektor kann Überhitzung – Set Inkubator auf niedrigere Temperatur während der Projektor eingeschaltet ist (z.B. 30 ° C anstelle von 37 ° C) – Hinweis Projektor als Wärmequelle Inkubator über Sollwert überhitzen können Entfernen Sie unnötige Quellen der Feuchtigkeit aus Inkubator, da diese Projektor Elektronik beeinflussen können Nein/niedrige Niveaus der Biofilm gebildet, nachdem über Nacht Beleuchtung, kein Wachstum von planktonischen Zellen entweder (d. h. Flüssigkeit ist klar) Falsch (Niveau) Antibiotikum – achten Sie darauf, 50 μg/mL Spectinomycin Überprüfen Sie, ob alles richtig M63 Rezept hinzugefügt wird Nein/niedrige Niveaus der Biofilm gebildet, nachdem über Nacht Beleuchtung, nur planktonischen Zellen (d. h. Flüssigkeit ist bewölkt) Überprüfen Sie Licht, Projektor sollte werden Beleuchtung blaues Licht mit 50 Wμ/cm ^ 2 bei 460 nm Wellenlänge Versuchen Sie Bakterien kürzer/länger nach 1: 1000 LB Subdilution Schritt vor dem Hinzufügen zu M63 wachsen zu lassen Restreak Bakterien auf LB-Platte, aus frischen Kolonie über Nacht stationäre Phase Kultur erzeugen beginnen Gewährleisten, Projektor arbeitet konsequent über Nacht – siehe Punkt oben Fuzzy Biofilm Muster, Hintergrund-Rauschen Streulicht von optischen Beleuchtungssystem reduzieren, reflektierende Oberflächen im Innenraum des Inkubators zu decken Erwägen Sie, Fotomaske basiert (im Gegensatz zu projektorbasierte) strukturierte Beleuchtung Check-Projektor ist auf der unteren Fläche der Biofilm Kultur Kammer richtig scharf. Tabelle 1: Gemeinsame Behandlung von Problemen.

Discussion

Im Hinblick auf die Notwendigkeit einer Recherche-Tools, die für Biofilm Strukturkontrolle ermöglichen, haben wir eine einfach zu bedienende Protokoll für bakterielle Biofilme mit dem pDawn-Ag43 optogenetische Konstrukt Musterung vorgestellt. Mit dieser Technik können E. Coli Biofilme optisch auf verschiedenen Oberflächen Umgebungen, einschließlich geschlossene Kammern, mit einer räumlichen Auflösung unter 25 μm angeordnet werden.

Alles in allem, dieses Protokoll in vier Hauptabschnitte unterteilt werden kann: (1) die Vorbereitung der pDawn-Ag43 Bakterien, (2) die Vorbereitung der optischen und Kultur Setup Hardware (3) die Pre-Beleuchtung Bakterienwachstum Schritte und (4) die Post-Beleuchtung Spülungen und Bildgebung.

Der kritische Teil des Abs. 1 ist die erfolgreiche Umwandlung der pDawn-Ag43 Plasmid in die E. Coli -Stamm von Interesse. Dies wird erleichtert durch qualitativ hochwertige gereinigtes Plasmid zu isolieren und generieren qualitativ hochwertige kompetente Zellen für die Umwandlung (Tabelle 1, Fehlerbehebung).

Der kritische Teil des Abschnitts 2 ist die Optimierung des Aufbaus Projektor, so dass die Beleuchtungsintensität ist an 50 Wμ/cm2 bei 460 nm Wellenlänge angepasst, und der Projektor richtig auf den Biofilm beispielhöhe scharf ist. Beachten Sie, dass in diesem Protokoll wir ein umgekehrtes Beleuchtung Setup beschreiben, wo der Projektor Licht von unten, nach oben in Richtung der Biofilm-Probe glänzt. Der Vorteil dieses Aufbaus ist, dass das Licht nur durch den unteren Rand der Kulturschale zu reisen, vor Erreichen der Biofilm-Bildung-Oberfläche. Beleuchtung von oben bedeutet, dass das Licht durch die flüssigen Medien über der Oberfläche des Biofilms, Reisen, die im Laufe des Wachstums, bewölkt mit planktonischen Zellen bekommt. Zusätzlich zu diesen Bedenken, es ist auch wichtig, um Streulicht in den optischen Aufbau so weit wie möglich, z. B. zu minimieren durch reflektierende Oberflächen auf der Innenseite des Inkubators Vertuschung – dadurch werden um schärfer gemusterten Biofilme zu erhalten. Über einen entsprechenden Hinweis schärfer Biofilm Muster erhalten Sie ebenfalls per Fußpedal einer Fotomaske um Beleuchtung Musterung (Abbildung 3D, Abbildung 4) zu steuern. Häufig auftretende Probleme erfordern Fehlerbehebung gehören Projektor Zuverlässigkeitsprobleme bei höheren Temperaturen (z.B. 37 ° C), die minimiert werden kann, durch Inkubation der Biofilm-Wachstum bei niedrigeren Temperaturen (z.B. 30 ° C) sowie Computer-Software, die bewirkt, dass Betriebssystem-Updates oder blaues Licht Filtern während der Nacht Wachstum (Tabelle 1). Es ist auch wichtig zu beachten, dass je nach Projektor und Inkubator Modell verwendet, es auch möglich ist, dass vom Projektor erzeugte Wärme in eine höhere Innentemperatur führt als Inkubator Temperatur, die einstellen korrigiert werden müssen.

Der kritische Teil des Abschnitts 3 ist zuverlässige und reproduzierbare bakterielle Proben erhalten, bevor sie durch die Beleuchtung verursacht werden. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, klonale Bakterienkolonien pDawn-Ag43 durch Streifen sie heraus auf einer nährbodenplatte und dann mithilfe der Flüssigkultur Schritte um sicherzustellen, dass die Bakterien beleuchtet/induziert in der späten exponentiellen Wachstumsphase in einem wiederholbaren zu erhalten Art und Weise.

Zu guter Letzt ist der kritische Teil des Abschnitts 4 gründlich, aber auch sanft die planktonischen Zellen bleiben nach der Biofilm Musterung Protokoll abzuwaschen; Daher empfiehlt es sich, mehrere sanft Spülen mit PBS Schritte.

Im Vergleich zu bestehenden Techniken für Zelle Musterung5,hat6, optische Biofilm Musterung basierend auf pDawn-Ag43 eine relativ niedrige Barriere für die Einreise zu bedienen, insofern es nicht, mikrofertigungsverfahren, Reinraum-Anlagen, komplexe erfordert Chemie oder Oberflächenvorbehandlung, ist noch immer noch in der Lage, Muster mit hoher Auflösung (25 μm) in der Regel mit Microfabrication Techniken verbunden. Die Methode erweitert Vorarbeiten auf bakterielle Fotolithografie zur Steuerung von Gen-Ausdruck-17. PDawn-Ag43 Plasmid beschränkt sich derzeit auf E. Coli, wie es einen pUC-basierte Ursprung der Replikation verwendet, aber pDawn und Ag43 beide kompatibel in anderen (Gram-negativen) Bakterien-Spezies sind. Genetische Techniken stehen zur Verfügung für die Einführung von potenziell Licht reguliert Biofilmbildung auf unterschiedliche Bakterienarten und stellt eine mögliche Richtung für zukünftige Forschung. Eine weitere mögliche Einschränkung der Technik ist, dass es funktioniert, indem Biofilmbildung in Stämmen mit schwachen native Biofilmbildung (z. B.MG1655 E. Coli). Jedoch haben Stämme mit starken native Biofilmbildung Biofilme Form unabhängig von Lichtverhältnissen, gemusterte Biofilmbildung mit pDawn-Ag43 wie beschrieben hier entgegensteht; doch können optogenetische Techniken noch anwendbar bei der Regulierung der Biofilmbildung beweisen. Wir beachten Sie, dass in anderen Zusammenhängen, alternative Methoden der Biofilm Musterung, wie über optische c-di-GMP Modulation18verfügbar sind.

Insgesamt werden pDawn-Ag43 basierte Strukturierung geeignet für den Einsatz in Anwendungen, untersuchen die Wirkung von Biofilm Struktur auf Funktion1 und daher abstimmbaren Kontrolle über Biofilm Musterung profitieren könnten – ein besonders relevant Beispiel, hervorzuheben ist die Untersuchung der mikrobiellen Ökologie in Biofilmen2. Zukünftige Richtungen gehören gemusterte Biomaterialien8,9 bzw. strukturierter bakteriengemeinschaften. Alternative Anwendungen dieses zugänglich Protokolls gehören auch Bio-Kunst19, die klare ästhetische Potenzial sowie formelle und informelle Life-Science Education20,21,22. Aus pädagogischer Sicht, das hier beschriebene Protokoll vereint viele relevante Techniken (Bakterienkultur, Transformation, Optik/optogenetik) und ist auch Modular erweiterbar (z.B.Mikrofluidik enthalten).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken für ihre Anregungen und Spormann-Labor für den Zugriff auf ihre confocal Mikroskop D. Glas, H. Kim N. Cira, A. Choksi, S. Rajan und B. Schlüssel. Darüber hinaus bestätigen die Autoren die Unterstützung von Stanford Bio-X Bowes und NSERC PGS Stipendien, National Institute of Health (R21-AI-139941) und der American Cancer Society (RSG-14-177-01).

Materials

DH5alpha/pDawn-Ag43 Addgene 107742 DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use
MG1655 E. coli Coli Genetic Stock Center – Yale University CGSC #6300 MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results
RFP expression plasmid iGEM biobricks J04450-pSB4K5bb Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43
Plasmid miniprep kit Qiagen 27104
LB broth powder Affymetrix 75852 Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec
LB agar powder Affymetrix 75851 Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates
Petri dishes Fisherbrand 431760
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate abcam ab141968 Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol
M63 media salts 5X solution Bio-world 705729 Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water
Casamino acids Amresco J851 Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)
Crystal violet  Acros organics 212120250 Dilute to 0.1% in water prior to use
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) Thermo Scientific 9990402 Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging
Phosphate buffered saline (PBS) solution  Gibco 10010023 Can also use PBS prepared from powder / tablets
6 well plate Fisherbrand 351146 Used as biofilm culture dish for representative results
PDMS kit Dow SYLGARD 184 Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography
1 mL syringe BD syringe 309659 For use with liquid handling with enclosed microchambers
Blunt tip needle CML supply 901-23-050 Attaches to 1 mL syringe
Lab tape Fisherbrand 15-901 Use to attach culture chamber to incubator ceiling
Bacterial incubator Sheldon Manufacturing SMI6 Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling
Portable projector Ivation IV-PJ-PRO-4-1 Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength
Optical breadboard base ThorLabs MSB6 Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards
Optical post ThorLabs TR8 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp
Optical post right-angle clamp ThorLabs RA90 Connects vertical and horizontal posts
Mounting base ThorLabs BA1S Connects optical breadboard base and vertical post
1/4"-20 screw ThorLabs SH25S050 Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base
1/4"-20 set-screw ThorLabs SS25E63D Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole
Optical power meter Newport 840 Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement
Optical power meter detector Newport 818-UV Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range
Adjustable ND filter K&F Concept SKU0689 Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture
Presentation-projector software Microsoft Powerpoint Any software that allows drawing / presentation will suffice
CAD software Autodesk  AutoCAD Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files
Film photomask Fineline Imaging n/a Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing
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References

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Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43. J. Vis. Exp. (140), e58625, doi:10.3791/58625 (2018).
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