Hoge resolutie patroon Biofilm afzetting met behulp van pDawn-Ag43

1. bereiding van pDawn-Ag43 bacteriestammen PDawn-Ag43 omvormen tot een stam E. coli van belang (Figuur 1). Groeien een klonen stam hosting pDawn-Ag43 plasmide (verkrijgbaar bij een plasmide repository) door het enten van de stam in de pond-Bouillon aangevuld met 50 μg/mL spectinomycine (LB + spec) in een buis van de cultuur (‘s nachts in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C). Gebruik vervolgens een miniprep kit om te oogsten van de plasmide gezuiverde pDawn-Ag4310. Kies een stam E. coli van belang zijn voor het patroon worden. PDawn-Ag43 is tot nu toe geverifieerd om te werken in MG16553 en BW25113. Gebruik een gangbaar protocol voor het genereren van bevoegde (b.v., chemisch bevoegde11 of electrocompetent12) voorraden van de gekozen E. coli stam (bijvoorbeeldMG1655). PDawn-Ag43-plasmide transformeren in de bevoegde bacteriën11,12, gevolgd door 1 h terugwinning en plaat op LB + spec agar platen. Toestaan van kolonies groeien ‘s nachts bij 37 ° C. Winkel de pDawn-Ag43 getransformeerd stammen. Enten van een één kolonie van pDawn-Ag43 van een LB + spec agarplaat in LB + spec Bouillon in een buis van de cultuur en het groeien in een schudden incubator (bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C) tot exponentiële fase (OD600 ~0.4 – 0.8). Voorraad voor het opslaan van de stam van de pDawn-Ag43 omgezet bij-80 ° C op lange termijn door het mengen van 1 mL van de cultuur met 1 mL steriele glycerol van 50% in een cryo-buis te verkrijgen van een 25% glycerol vriezer voorraad voor te bereiden. Bewaar dit in een vriezer-80 ° C. Als extra plasmiden (b.v., fluorescerende verslaggever plasmiden) moeten worden omgezet, maken de bevoegde cellen11,12 van de pDawn-Ag43 getransformeerd stam en herhaal het transformatie proces11 , 12 voor de extra plasmiden zoals nodig.Opmerking: Als electroporation8gebruikt, is het mogelijk om cotransform van meerdere plasmiden (met inbegrip van pDawn-Ag43) tegelijkertijd; echter is een gelijktijdige transformatie niet aanbevolen referentiemethoden chemisch te worden verwerkt, zoals de grote omvang (> 10 kB) van pDawn-Ag43 betekent transformatie efficiëntie worden verlaagd. 2. voorbereiding van de Projector optische Set-up voor verhelderend bacteriën Verkrijgen van een bacteriële incubator met niet-transparante muren en een gat voor het doorgeven van kabels, een draagbare projector geschikt voor montage en functioneren binnen de bacteriële incubator, en een laptop uitgerust met software voor presentatie-projectie (Zie tabel van Materialen). Wanneer het kiezen van de projector en de incubator, ervoor zorgen dat de minimale scherpstelafstand van de projector is minder dan de binnenhoogte van de incubator. Plaats de projector in de incubator aan de onderkant, met de diafragma wijzen direct naar boven, naar het plafond, waar de biofilm cultuur kamer is gekoppeld (Figuur 2). Correctie van de projector in plaats door de aanleg van een installatie met een optische breadboard basis verbonden aan een verticale post, verbonden op zijn beurt met een horizontale post welke schroeven in de projector (Figuur 2). Merk op dat deze set-up kan worden gewijzigd, afhankelijk van de projector/beschikbare onderdelen. Uiteindelijk is het belangrijkste vereiste is dat de projector stevig wordt bevestigd in de buurt van de onderkant van de incubator, met de opening naar boven wijzen. Sluit de laptop via de kabel van weergave (bijvoorbeeldHDMI) aan op de projector in de incubator. Als de oppervlakken — vooral het plafond — van het interieur van de incubator worden reflecterende (bijvoorbeeldmetalen gepolijste oppervlak), dek ze af met donkere matte oppervlakken te minimaliseren reflecties. Tape gebruiken om een lege ‘dummy’ cultuur schotel hechten aan het plafond van de incubator. Merk op dat, zoals met de projector, er meerdere aanvaardbaar manieren zijn om het koppelen van een schotel van cultuur; Zorg ervoor dat het oppervlak van de transparante onderstuk van de kamer van de cultuur, waar verlichting voorkomt, niet bedekt is. De focus op de projector aanpassen door te draaien aan de focus knop zodat het scherpstellen vliegtuig met de onderkant van de schotel van de cultuur van de biofilm (bijvoorbeeldeen goed plaat samenvalt) gekoppeld aan het plafond van de incubator (Figuur 2). De projector moet het verlichten van een scherpe, niet-wazig beeld op de bodem van de schotel cultuur. Verwijder de ‘dummy’ cultuur schotel zodra de projectie is geoptimaliseerd. Laptop softwarematig, direct de projector voor de verlichting van het volledige gezichtsveld met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]) door de indiening van een volledige blauwe dia. Meet de intensiteit van de verlichting van de projector met behulp van een optische Energiemeter door het hoofd van de foto-elektrische cel plaatsen bij de incubator plafond en de intensiteit van de overeenkomstige Energiemeter gekalibreerd tot licht golflengte 460 nm te lezen. Volg de instructies over het aansluiten en het kalibreren van de foto-elektrische cel voor de specifieke Energiemeter gebruikt. Omgevingslicht te verminderen (b.v., kamer lichten uit te schakelen, of de incubator plaats uit de buurt van lichtbronnen) zo veel mogelijk alvorens de verlichting intensiteit metingen. Pas de intensiteit van de verlichting met behulp van een verstelbare neutrale-opaciteitsfilter geplaatst op de opening van de projector. Draai het filter om aan te passen van de intensiteit van de verlichtingssterkte gemeten door de Energiemeter, totdat de intensiteit van de verlichting in het midden van de blauw-licht geprojecteerde regio 50 μW/cm2 leest.Opmerking: Hoewel het mogelijk is om de intensiteit van de verlichting met behulp van lagere blauw RGB-waarden aan de software kant, met behulp van een filter terwijl het maximaliseren van de waarde voor blauw RGB-het voordeel heeft van het maximaliseren van de optische contrast van het systeem tussen verlichte versus. donkere regio’s. Tekenen van willekeurige patronen met behulp van de software van de presentatie/projector op de laptop en deze patronen weergeven op het plafond van de incubator, met behulp van de projector.Opmerking: Biofilm-vormende regio’s moeten worden getekend met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]), niet-biofilm-vorming van regio’s met geen verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 0]). 3. het kweken van patroon Biofilms Vóór de verlichting, de pDawn-Ag43-bacteriën, vanaf de glycerol vriezer voorraad, zodat ze op betrouwbare wijze worden veroorzaakt in de late fase van de exponentiële groei voor verlichting (figuur 3A) te bereiden. Strijk een pDawn-Ag43-stam uit glycerol voorraad op LB + spec agar platen. Toestaan van kolonies groeien overnachting (37 ° C).Opmerking: Vanaf hier tot de verlichting cultuur stap, zorgen de cellen blijven zo veel mogelijk in het donker — korte perioden op ambient verlichting (bijvoorbeeldvoor subdilution) zijn aanvaardbaar. Enten van een kolonie van pDawn-Ag43 bacteriën uit een agarplaat in LB + spec Bouillon en groeien de cultuur ‘s nachts aan de stationaire fase (in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C, voor ~ 16 h). Subdilute van de cultuur in een verhouding van 1:1,000 met LB + spec Bouillon (bv1 μL van overnachting cultuur toevoegen aan 1 mL verse LB + spec). Laat de subdiluted cultuur te groeien tot de laat-exponentiële/vroeg-stationaire groeifase (OD ~ 1.0, ~ 6 h in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C). Tijdens het wachten voor de cultuur te groeien, bereiden M63 media met 1 x M63 zouten, 1 mM MgSO4, 0,2% glucose, 0,1% casamino zuren en 50 μg/mL spectinomycine in water (zorgen voor de samenstellende delen zijn steriel). Subdilute de cultuur van de laat-exponentiële-fase bij een verhouding van 1:100 met M63 media aangevuld met 50 μg/mL spectinomycine. De verdunning in een biofilm cultuur schotel vervolgens, in te voeren (bijvoorbeeldhet verdunde monster Pipetteer in een goed plaat).Opmerking: De hoeveelheden die nodig zijn voor deze 1:100 subdilution hangt de schotel van de cultuur wordt gebruikt (bijvoorbeeld, als met een 6-well polystyreen goed plaat [niet–Weefselkweek behandeld], één sample zou vereisen 20 μL van cultuur aan 2 mL M63 + spec, toe te voegen als de standaard goed volume van een 6-well plaat is ~ 2 mL). Als de monsters nu gereed voor verlichting zijn, tape de cultuur schotel aan het plafond van de incubator, ervoor te zorgen dat het oppervlak aan de onderkant van de schotel transparant voor de verlichting van onderaf door de projector is.Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het plafond van de incubator niet reflecterende is, tot een minimum beperken van verdwaalde verlichting. Verdwaalde verlichting kan ook worden verminderd door het gebruik van zwart-ommuurde platen als cultuur gerechten, hoewel dit niet strikt noodzakelijk is — als dergelijke platen gebruikt, controleert de onderkant is transparant. De biofilms aan cultuur in de incubator’s nachts (16 h met geen schudden, bij 37 ° C) toestaan. Merk op dat sommige projectoren minder betrouwbaar bij hogere temperaturen worden. Als dat het geval, houdend cultuur bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld30 ° C), in mening dat de incubatietijd worden verhoogd moeten kan, afhankelijk van de stam E. coli . 4. imaging patroon Biofilms Na de overnachting groei van de biofilm monsters, de cultuur schotel uit de incubator te verwijderen. Het gerecht zal hebben biofilm bacteriën gekoppeld aan de onderkant, waar het heeft zijn verlicht, evenals planktonische bacteriën verspreid in de vloeibare media hierboven. Gooi de planktonische cellen door het verwijderen van het vloeibare media uit de cultuur schotel (bijvoorbeelddoor met een pipet zachtjes zuigen). Spoel het monster 2 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing voor het verwijderen van de resterende planktonische cellen (figuur 3B) door het voorzichtig pipetteren in PBS, gevolgd door aspiratie. Als de cellen zijn fluorescently gecodeerd, direct het imago van de monsters met behulp van fluorescentie microscopie13 (b.v., breed-gebied13, 3D-confocale14, enz.).Opmerking: TL biofilms kunnen ook worden bewaard met behulp van een zelf verharden montage medium. Toepassen van één druppel media een biofilm steekproef te monteren, bedek het met een dekglaasje glas aan, niet te vangen luchtbellen onder, het verzorgen en laten harden’s nachts voor imaging. Als de gebruikte bacteriële cellen fluorescently niet zijn gecodeerd, gelden de kristalviolet vlek techniek15 (figuur 3B) van biofilm contrast verbeteren voorafgaand aan de beeldvorming. 5. protocol wijzigingen/alternatieven PDawn-Ag43 bacteriën op verschillende oppervlakken te groeien. Glas- of poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) kortingsbonnen (bijvoorbeeld, coverslips of dunne reepjes van PDMS) gestoken met goed platen voordat het prestatiemeteritembestand van een bacteriële monster/verlichting, en volg hetzelfde protocol als voorheen naar patroon pDawn-ag43 biofilms op glas en PDMS. PDawn-Ag43 bacteriën in een transparante, gesloten cultuur kamer groeien. Het genereren van een schimmel cultuur kamer voor PDMS. Genereren voor een fundamentele cultuur kamer, schimmel door een harde, rechthoekige Prisma op een plat oppervlak (de prism zal een holte in de PDMS die als de cultuur zaal fungeert zodra de schimmel wordt geworpen worden). Merk op dat meer ingewikkelde cultuur kamer mallen kunnen worden vervaardigd met behulp van zachte lithografie16. Een holte PDMS voorstemmen PDMS in de mal gieten en het te genezen (Zie voor een gedetailleerde zachte litho-protocol, JoVE van Science Education Database16). Na uitharding trim eventuele overtollige PDMS, punch inlaat/uitlaat kanalen in de bedwelmingsruimte holte/cultuur en de holte op een plat oppervlak (bijvoorbeeld, glas/polystyreen) band door stevig op de PDMS op de vlakke ondergrond, waardoor de holte tussen het oppervlak en het PDMS plafond als de biofilm cultuur kamer.Opmerking: Meer permanente hechting op basis van plasma behandeling16 kan ook worden gebruikt, maar de chips zal dan niet herbruikbaar zijn. Volg het protocol van de cultuur als voorheen, met behulp van een spuit met het botte uiteinde naalden (in plaats van een pipet) te introduceren het bacteriële monster in de cultuur kamer/spoelen met PBS buffer (Figuur 3 c). Als met een tijdelijk gekleefde Holte, gebruikt u alleen negatieve druk te trekken van de kamer, om ervoor te zorgen dat de holte niet unbonded van het onderliggende oppervlak van het glas/polystyreen tot vloeibare in/out. PDawn-Ag43-bacteriën met behulp van een photomask film voor gestructureerde verlichting groeien. Het ontwerp van een patroon van de biofilm met behulp van CAD software compatibel is met een film photomask printer/print service. Het ontwerp van de film photomask moeten duidelijk in regio’s waar de biofilm is bedoeld om te worden afgedrukt, en zwart/ondoorzichtig elders. Als alles klaar is, het photomask-bestand naar de printer/afdrukservice verzendt en wachten op de terugkeer van de fysieke photomask. Instrueren van de projector voor het verlichten van een volledige gezichtsveld met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]) laptop softwarematig. Knip uit een regio van belangstelling van de grotere photomask van de film, en tape het rechtstreeks naar de onderkant van de biofilm cultuur schotel vóór invoering van het bacteriële monster voor overnachting verlichting (figuur 3D). Cultuur van de biofilms als voorheen en verwijder de photomask na het kweken, voorafgaand aan de beeldvorming.