PDawn-Ag43 modelado usando de deposição de biofilme em alta resolução

1. preparação do pDawn-Ag43 estirpes bacterianas PDawn-Ag43 transforme uma cepa de Escherichia coli de interesse (Figura 1). Cresce uma estirpe de clonagem hospedagem pDawn-Ag43 plasmídeo (obtido a partir de um repositório de plasmídeo) por inoculação da estirpe em caldo LB suplementado com 50 espectinomicina μg/mL (LB + spec) em um tubo de cultura (durante a noite em uma incubadora agitando a ~ 250 rpm, 37 ° C). Em seguida, use um kit miniprep para colher o de plasmídeo purificado pDawn-Ag4310. Escolha uma cepa de Escherichia coli de interesse a ser modelado. Até então, pDawn-Ag43 foi verificada para trabalhar em MG16553 e BW25113. Usar um protocolo estabelecido para gerar competentes(por exemplo, quimicamente competentes11 ou electrocompetent12) as existências dos escolhidos estirpe de Escherichia coli (por exemplo, MG1655). PDawn-Ag43 plasmídeo transforme as bactérias competentes11,12, seguido de recuperação de 1 h e placa no LB + placas de ágar espec. Permitir colônias a crescer durante a noite a 37 ° C. Loja do pDawn-Ag43 transformado cepas. Inocular uma única colônia de pDawn-Ag43 de um LB + placa de ágar de especificações em LB + spec caldo em um tubo de cultura e cultivá-la em uma incubadora de agitação (a ~ 250 rpm, 37 ° C) para fase exponencial (OD600 ~0.4 – 0.8). Prepare ações para armazenar a tensão pDawn-Ag43 transformada a-80 ° C a longo prazo através da mistura de 1 mL de cultura com 1 mL de glicerol a 50% estéril em um tubo de congelação para obter um 25% de glicerol estoque do congelador. Guarde isto em um freezer-80 ° C. Se plasmídeos adicionais (por exemplo, plasmídeos repórter fluorescentes) precisam ser transformado, criar células competentes11,12 da pDawn-Ag43 transformado estirpe e repita o processo de transformação11 , 12 para plasmídeos adicionais conforme necessário.Nota: Se utilizar a eletroporação8, é possível cotransform plasmídeos múltiplas (incluindo pDawn-Ag43) simultaneamente; no entanto, uma transformação simultânea não é recomendável usando métodos de transformação química, como o tamanho grande (> 10 kB), de pDawn-Ag43 significa eficiência de transformação é reduzida. 2. preparação do projetor óptico afinação para bactérias iluminantes Obter uma incubadora bacteriana com paredes transparentes e um furo para a passagem de cabos, um projetor portátil capaz de montagem e o funcionamento dentro da incubadora bacteriana, e um laptop equipado com software de apresentação-projeção (ver tabela de de Materiais). Ao escolher o projetor e a incubadora, certifique-se de que a distância mínima de foco do projetor é menor que a altura interior da incubadora. Coloque o projetor dentro da incubadora na parte inferior, com a abertura apontando diretamente para cima, no teto, onde a câmara de cultura do biofilme é anexado (Figura 2). Fix o projetor no local construindo uma armadilha com uma base de experimentação ótica conectado a um poste vertical, por sua vez conectado a um poste horizontal que parafusos para o projetor (Figura 2). Observe que essa configuração pode ser modificada dependendo as peças projetor/disponível. Em última análise, o requisito essencial é que o projetor é solidamente fixado na parte inferior da incubadora, com a abertura apontando para cima. Conecte o notebook através do cabo do monitor (por exemplo, HDMI) o projetor dentro da incubadora. Se as superfícies — especialmente o teto — do interior da incubadora são reflexivo (por exemplo, superfície de metal polido), cubra-os com superfícies fosca escuras para minimizar os reflexos. Use fita para anexar um prato vazio ‘manequim’ cultura no tecto da incubadora. Observe que, como com o projetor, existem várias maneiras aceitáveis para anexar um prato de cultura; Certifique-se de que a superfície de fundo transparente da câmara de cultura, onde ocorre a iluminação, não é coberta. Ajuste o foco no projetor girando o botão de focalização para que o avião de focagem coincide com a superfície inferior do prato biofilme cultura (por exemplo, uma placa bem) anexada ao teto da incubadora (Figura 2). O projetor deve acender-se uma imagem não-embaçada afiada para o fundo do prato a cultura. Retire o prato de cultura ‘manequim’ uma vez que a projeção foi otimizada. Utilizando o software portátil, direto do projetor para iluminar o campo de visão completo com iluminação azul máxima (por exemplo, RGB = [0, 0, 255]), apresentando um slide completo azul. Medir a intensidade de iluminação do projetor usando um medidor de potência óptica colocando a fotodetector de cabeça para o teto da incubadora e lendo a intensidade sobre o medidor de energia correspondente calibrado para luz de comprimento de onda 460 nm. Siga as instruções na conexão e calibrando o fotodetector para o medidor de energia específico usado. Reduzir a luz ambiente (por exemplo, desligar as luzes do quarto, ou coloque a incubadora, longe de fontes de luz) o máximo possível antes de fazer a iluminação medições de intensidade. Ajuste a intensidade de iluminação usando um filtro de densidade neutra ajustável colocado na abertura do projetor. Gire o filtro para ajustar a intensidade de iluminação medida pelo medidor de energia, até que a intensidade de iluminação no centro da região projetada da luz azul lê 50 μW/cm2.Nota: Enquanto é possível ajustar a intensidade de iluminação usando valores mais baixos de RGB azuis do lado do software, usando um filtro enquanto maximizar o valor RGB azul tem a vantagem de maximizar o contraste ótico do sistema entre iluminado vs . regiões escuras. Desenhar padrões arbitrários usando o software de apresentação/projetor no laptop e exibir esses padrões no teto da incubadora, utilizando o projetor.Nota: As regiões formadoras de biofilme devem ser desenhadas com iluminação azul máxima (por exemplo, RGB = [0, 0, 255]), regiões não-formação de biofilme com nenhuma iluminação (por exemplo, RGB = [0, 0, 0]). 3. cultivo de biofilmes estampados Antes da iluminação, prepare as bactérias pDawn-Ag43, a partir do estoque de congelador de glicerol, para que eles são induzidos confiantemente em fase de crescimento exponencial tardia para iluminação (Figura 3A). Marcam uma estirpe de pDawn-Ag43 do estoque de glicerol em LB + placas de ágar especs. Permitir colônias a crescer durante a noite (37 ° C).Nota: Daqui até a etapa de cultura de iluminação, garantir que as células fiquem no escuro, tanto quanto possível — breves períodos de iluminação ambiente (por exemplo, para subdilution) são aceitáveis. Inocular uma colônia de bactérias pDawn-Ag43 de uma placa de ágar em LB + caldo de especificações e crescer a cultura durante a noite para uma fase estacionária (em uma incubadora agitando a ~ 250 rpm, 37 ° C, para ~ 16 h). Subdilute a cultura em uma relação de 1:1,000 com LB + caldo de especificações (por exemplo, adicionar 1 mL de LB fresco + especificação 1 μL da cultura durante a noite). Permitir que a cultura subdiluted a crescer até o final da fase exponencial/início estacionária (OD ~ 1.0, ~ 6 h numa incubadora agitando a ~ 250 rpm, 37 ° C). Enquanto espera para a cultura a crescer, preparar a M63 mídia com sais x M63 1, 1mm MgSO4, 0,2% de glicose, ácidos de casamino de 0,1% e espectinomicina 50 μg/mL em água (certifique-se de partes constituintes são estéreis). Subdilute a cultura de fase tardia-exponencial na proporção de 1: 100 com mídia M63 suplementada com 50 espectinomicina μg/mL. Em seguida, introduzir a diluição em um prato de cultura de biofilme (p. ex., pipetar amostra diluída em um prato bem).Nota: Os volumes necessários para esta subdilution de 1: 100 dependem do prato de cultura sendo usado (por exemplo, se utilizar uma placa bem 6-poços em poliestireno [não-tecido-cultura tratada], uma única amostra exigiria adicionar 20 μL da cultura a 2 mL de M63 + especificação, como o volume bem padrão de uma placa de 6 é de ~ 2 mL). Como as amostras agora estão prontas para a iluminação, fita o prato de cultura para o teto da incubadora, garantindo que a superfície no fundo do prato é transparente para a iluminação de baixo pelo projector.Nota: É importante garantir que o teto da incubadora não é reflexivo, para minimizar a iluminação de rua. Iluminação de rua também pode ser reduzida usando placas de parede preto como pratos de cultura, embora isso não seja estritamente necessário — se usando tais placas, certifique-se de superfície de fundo é transparente. Permitir que os biofilmes à cultura na incubadora durante a noite (16 h com nenhum tremor, a 37 ° C). Observe que alguns projetores tornam-se menos confiáveis em temperaturas mais altas. Se for esse o caso, a cultura a temperaturas mais baixas (por exemplo, 30 ° C), mantendo em mente que o tempo de incubação pode ser necessário aumentar, dependendo da estirpe de Escherichia coli . 4. imagem padronizada de biofilmes Após o crescimento noturno das amostras de biofilme, retire o prato de cultura da incubadora. O prato terá bactérias do biofilme anexadas a sua superfície inferior onde tem sido iluminada, bem como bactérias planctônicas dispersadas na mídia líquida acima. Descarte as células planctônicas, removendo o meio líquido do prato da cultura (por exemplo, aspirando suavemente com uma pipeta). Enxágue a amostra 2 x com uma solução de tampão fosfato salino (PBS) para remover as células restantes planctônicas (Figura 3B) pipetando suavemente em PBS, seguido de aspiração. Se as células são marcadas fluorescentemente, diretamente da imagem as amostras usando fluorescência, microscopia13 (por exemplo, campo largo13, 3-d confocal14, etc.).Nota: Biofilmes fluorescentes podem também ser preservados usando um meio de montagem a Self-hardening. Aplique uma gota de mídia para uma amostra de biofilme de montagem, cubra-o com uma lamela de vidro, tomando cuidado para não capturar quaisquer bolhas por baixo e deixe-o endurecer durante a noite antes de imagem. Se as células bacterianas utilizadas não são marcadas fluorescentemente, aplica o cristal violeta mancha técnica15 (Figura 3B) para realçar o contraste de biofilme antes da imagem latente. 5. protocolo modificações/alternativas Crescem as bactérias pDawn-Ag43 em diferentes superfícies. Colocar o vidro ou cupons (PDMS) de poli-dimetil-siloxano (por exemplo, lamelas ou tiras finas de PDMS) em placas bem antes da adição de uma amostra bacteriana/iluminação e seguem o mesmo protocolo como antes para o padrão pDawn-ag43 biofilmes em vidro e PDMS. Crescem as bactérias pDawn-Ag43 dentro de uma câmara de cultura transparente, fechado. Gere um molde de câmara de cultura para PDMS. Para uma câmara de cultura básica, gere mofo, anexando um prisma retangular, difícil para uma superfície plana (o prisma vai se tornar uma cavidade no PDMS que serve como a câmara de cultura, uma vez que o molde é convertido). Observe que mais intrincados moldes de câmara de cultura podem ser fabricados usando uma litografia macia16. Conversão de uma cavidade PDMS derramando PDMS no molde e permitindo-lhe curar (para um protocolo detalhado litografia macia, consulte banco de dados de educação ciência16 do JoVE). Após a cura, apare qualquer excesso PDMS, socar canais de entrada/saída na câmara de cavidade/cultura e vínculo da cavidade de uma superfície plana (por exemplo, vidro/poliestireno) pressionando firmemente o PDMS para a superfície plana, deixando a cavidade entre a superfície e o teto de PDMS como a câmara de cultura do biofilme.Nota: Ligação permanente com base no tratamento de plasma16 também pode ser usada, mas os chips não será reutilizáveis. Segui o protocolo de cultura como antes, usando uma seringa com agulhas de ponta romba (em vez de uma pipeta) para introduzir a amostra bacteriana a câmara de cultura/enxaguar com tampão PBS (Figura 3). Se usando uma cavidade temporariamente ligada, use pressão negativa apenas para puxar o líquido em/fora da câmara, para garantir que a cavidade não se torne unbonded da superfície de vidro/poliestireno subjacente. Crescem as bactérias pDawn-Ag43 usando uma filme Fotomáscara para iluminação estruturada. Desenha um padrão de biofilme usando software CAD compatível com o serviço de impressora/print Fotomáscara um filme. O projeto de filme de Fotomáscara deve ser claros em regiões onde o biofilme destina-se a ser impresso e preto/opaco em outro lugar. Quando completo, enviar o arquivo Fotomáscara para o serviço de impressora/impressão e aguardam o retorno da Fotomáscara físico. Instruir o projetor para iluminar um campo de visão completo com iluminação azul máxima (por exemplo, RGB = [0, 0, 255]) usando o software portátil. Corte uma região de interesse do maior filme de Fotomáscara e fita diretamente para o fundo de cultura de biofilme prato antes de introduzir a amostra bacteriana para iluminação durante a noite (Figura 3D). Cultura de biofilmes como antes e remover a Fotomáscara após cultivo, antes da imagem latente.