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Bioengineering

Alta risoluzione svevapacifico modellato mediante deposizione di Biofilm-Ag43

Published: October 23, 2018
doi:
10.3791/58625
,
1Department of Bioengineering,Stanford University

Summary

Dimostriamo un metodo per il deposito di biofilm batterici di Escherichia coli in modelli spaziali arbitrarie con un’alta risoluzione usando lo stimolo ottico di un costrutto di superficie-adesione codificato geneticamente.

Abstract

Campitura e struttura spaziale gioca un ruolo importante nel biofilm batterici. Qui dimostriamo un metodo accessibile per la coltura di Escherichia coli biofilm in arbitrario pattern spaziali ad alta risoluzione spaziale. La tecnica utilizza un costrutto codificato geneticamente optogenetica — svevapacifico-Ag43 — che coppie di biofilm in e. coli alla stimolazione ottica di luce blu. Dettagliamo il processo per la trasformazione di e. coli con svevapacifico-Ag43, preparare il set-up ottico richiesto e il protocollo per la coltura di biofilm modellato utilizzando batteri svevapacifico-Ag43. Usando questo protocollo, biofilm con una risoluzione spaziale inferiore a 25 μm può essere basato su diverse superfici e ambienti, comprese le camere chiuse, senza la necessità di microfabbricazione, pulizia in camera o pretrattamento superficiale. La tecnica è conveniente e appropriato per l’utilizzo in applicazioni che studiare l’effetto della struttura del biofilm, garantendo un controllo sintonizzabile sui biofilm patterning. Più in generale, ha anche applicazioni potenziali in biomateriali, educazione e bio-arte.

Introduction

I biofilm sono collegata alla superficie comunità di microbi e sono ben noti per il loro accoppiamento forte struttura-funzione. Geometria spaziale e patterning di biofilm gioca un ruolo importante nella funzione di comunità globale (e viceversa)1. La lunghezza di piccola scale coinvolta nella struttura del biofilm — nell’ordine di decine di micron2— rendere sintonizzabile e comodo controllo del biofilm patterning un problema provocatorio. Qui dimostriamo un protocollo che consente di biofilm di essere precisamente modellato in geometrie arbitrarie, basate sull’illuminazione ottica.

Utilizza il protocollo presentato qui svevapacifico-Ag433, un costrutto di optogenetica che le coppie di biofilm in batteri e. coli per illuminazione ottica guidando l’espressione di Ag43 (un gene della adesina responsabile adesione alla superficie e biofilm formazione) sotto il controllo di svevapacifico4 (un regolatore trascrizionale controllato da illuminazione ottica). Il metodo è comodo da usare e può modello biofilm su vari ambienti, comprese le camere di cultura (trasparente) recintato di superficie. Rispetto ai metodi di deposizione di cella esistente, ad esempio deposizione basata su goccia5 o superficie prepatterning trattamenti6, svevapacifico-Ag43 non richiede strutture di microfabbricazione o pulito e non necessita di materiali di là di quelli disponibile ad un laboratorio di microbiologia tipico. È in grado di modello con una risoluzione spaziale inferiore a 25 μm, avvicinando le dimensioni spaziali di microcolonies in naturalmente esistenti biofilm2. Nel complesso, questa tecnica offre la possibilità di modificare la struttura del biofilm, che poi si apre molte strade per studiare microecology in comunità batteriche7. Inoltre, fantasia biofilm può fornire una comoda piattaforma sulla quale ingegnere biomateriali utile8,9. In questa carta, discutiamo il protocollo di base necessario per patterning biofilm utilizzando svevapacifico-Ag43 e affrontare potenziali modifiche e la risoluzione dei problemi relativi al metodo.

Protocol

1. preparazione del svevapacifico-Ag43 ceppi batterici Svevapacifico-Ag43 si trasformano in un ceppo di e. coli di interesse (Figura 1). Crescere un ceppo di clonazione hosting svevapacifico-Ag43 plasmide (ottenibile da un repository di plasmide) inoculando il ceppo in brodo LB completato con 50 spectinomicina μg/mL (LB + spec) in un tubo di cultura (pernottamento in un incubatore d’agitazione a ~ 250 giri/min, 37 ° C). Quindi, utilizzare un kit miniprep per raccogliere il plasmide purificato svevapacifico-Ag4310. Scegliere un ceppo di e. coli di interesse da campire. Finora, svevapacifico-Ag43 è stata verificata per lavorare in MG16553 e BW25113. Utilizzare un protocollo stabilito per generare competenti (ad es., chimicamente competenti11 o electrocompetent12) scorte del scelto Escherichia coli ceppo (ad es., MG1655). Svevapacifico-Ag43 plasmide si trasformano nei batteri competenti11,12, seguito dal recupero di 1 h e piastra su LB + piastre di agar spec. Permettere le colonie a crescere durante la notte a 37 ° C. Negozio svevapacifico-Ag43 trasformato ceppi. Inoculare una colonia singola di svevapacifico-Ag43 da un LB + spec piastra di agar in LB + spec brodo in un tubo di cultura e crescere in un incubatore agitazione (a ~ 250 giri/min, 37 ° C) alla fase esponenziale (OD600 ~0.4 – 0,8). Preparare il brodo per memorizzare il ceppo svevapacifico-Ag43 trasformato a-80 ° C a lungo termine da 1 mL di coltura di miscelazione con 1 mL di glicerolo sterile al 50% in un crio-tubo per ottenere un 25% glicerolo Stock in congelatore. Conservare questo in un congelatore a-80 ° C. Se ulteriori plasmidi (ad es., plasmidi reporter fluorescente) bisogno di essere trasformato, creare cellule competenti11,12 svevapacifico-Ag43 trasformato ceppo e ripetere il processo di trasformazione11 , 12 per ulteriori plasmidi come necessario.Nota: Se si utilizza l’elettroporazione8, è possibile cotransform più plasmidi (tra cui svevapacifico-Ag43) contemporaneamente; Tuttavia, una trasformazione simultanea non è raccomandata utilizzando metodi di trasformazione chimica, come le grandi dimensioni (> 10 kB) di svevapacifico-Ag43 significa efficienze di trasformazione sono ridotti. 2. preparazione del proiettore ottico assetto per batteri illuminanti Ottenere un incubatore batterico con pareti non trasparenti e un foro per il passaggio di cavi, un proiettore portatile capace di montaggio e funzionamento all’interno dell’incubatrice batterica, e un computer portatile dotato di software per la presentazione-proiezione (Vedi tabella di Materiali). Quando si sceglie il proiettore e incubatore, assicurarsi che la distanza minima di messa a fuoco del proiettore sia inferiore l’altezza interna dell’incubatore. Posizionare il proiettore all’interno dell’incubatrice nella parte inferiore, con l’apertura verso l’alto, direttamente verso l’alto, verso il soffitto, dove si trova l’alloggiamento della coltura di biofilm allegata (Figura 2). Correzione il proiettore in posto mediante la costruzione di un set-up con una breadboard ottico base collegato ad un palo verticale, a sua volta collegato ad un palo orizzontale che si avvita nel proiettore (Figura 2). Si noti che questa impostazione può essere modificata a seconda delle parti del proiettore/disponibile. In definitiva, il requisito fondamentale è che il proiettore è solidamente fissato nella parte inferiore dell’incubatrice, con l’apertura rivolta verso l’alto. Collegare il computer portatile tramite il cavo del display (ad es., HDMI) il proiettore all’interno dell’incubatrice. Se le superfici — specialmente il soffitto — dell’interno dell’incubatrice sono riflettenti (ad es., superficie lucidata del metallo), coprirli con superfici scure opache per minimizzare i riflessi. Utilizzare nastro per fissare una piastra di coltura ‘fittizio’ vuoto al soffitto dell’incubatore. Si noti che, come con il proiettore, non ci sono più modi accettabili per fissare una piastra di coltura; Assicurarsi che la superficie di fondo trasparente della sezione cultura, dove si verifica l’illuminazione, non è coperto. Regolare la messa a fuoco del proiettore girando la manopola di messa a fuoco in modo che il piano di messa a fuoco coincide con la superficie inferiore della piastra di coltura di biofilm (ad es., un piatto ben) attaccata al soffitto dell’incubatore (Figura 2). Il proiettore deve illuminare un’immagine nitida e non sfocata sul fondo della piastra di coltura. Rimuovere la piastra di coltura ‘fittizio’ una volta che la proiezione è stata ottimizzata. Utilizzando software di computer portatile, diretto il proiettore per illuminare il campo visivo completo con massima illuminazione blu (ad esempio, RGB = [0, 0, 255]) presentando una diapositiva completo blu. Misurare l’intensità di illuminazione del proiettore utilizzando un misuratore di potenza ottica di posizionamento della testa del rivelatore fotoelettrico il soffitto di incubatrice e leggendo l’intensità sul corrispondente misuratore calibrato a lunghezza d’onda chiara 460 nm. Seguire le istruzioni sul collegamento e calibrare la cellula fotoelettrica per il misuratore di potenza specifico utilizzato. Ridurre la luce ambiente (ad es., spegnere le luci in camera o posto l’incubatrice lontano da fonti di luce) per quanto possibile prima misure di intensità di illuminazione. Regolare l’intensità di illuminazione utilizzando un filtro a densità neutra regolabile collocato presso l’apertura di proiettore. Ruotare il filtro per regolare l’intensità di illuminazione misurato al contatore di potenza, fino a quando l’intensità di illuminazione nel centro della regione proiettata luce blu legge 50 μW/cm2.Nota: Mentre è possibile regolare l’intensità di illuminazione utilizzando valori RGB blu inferiori sul lato software, utilizzando un filtro mentre massimizzando il valore RGB blu ha il vantaggio di massimizzare il contrasto ottico del sistema tra illuminate vs. zone buie. Disegnare modelli arbitrari utilizzando il software di presentazione/proiettore sul portatile e visualizzare questi modelli sul soffitto dell’incubatore, uso del proiettore.Nota: Le regioni che formano Biofilm devono essere disegnate con massima illuminazione blu (ad esempio, RGB = [0, 0, 255]), regioni-di formare biofilm con nessuna illuminazione (ad esempio, RGB = [0, 0, 0]). 3. coltura di biofilm a motivi Prima dell’illuminazione, preparare i batteri svevapacifico-Ag43, a partire da Stock in congelatore il glicerolo, affinché siano indotti in modo affidabile in fase di crescita esponenziale tardiva per l’illuminazione (Figura 3A). Inoculare un ceppo svevapacifico-Ag43 da Stock in glicerolo sul LB + piastre di agar spec. Permettere le colonie a crescere durante la notte (37 ° C).Nota: Da qui fino al passaggio di cultura di illuminazione, garantire le cellule rimanere quanto più possibile all’oscuro — brevi periodi presso illuminazione ambientale (ad es., per subdilution) sono accettabili. Inoculare una colonia di batteri svevapacifico-Ag43 da una piastra di agar in LB + spec brodo e far crescere la cultura durante la notte a fase stazionaria (in un incubatore d’agitazione a ~ 250 giri/min, 37 ° C, per ~ 16 h). Subdilute la cultura ad un rapporto di 1:1,000 con LB + spec brodo (ad esempio, aggiungere 1 μL di coltura durante la notte a 1 mL di LB fresco + spec). Consentire la cultura subdiluted a crescere fino alla fine della fase stazionaria esponenziale e l’inizio (OD ~ 1.0, ~ 6 h in un incubatore d’agitazione a ~ 250 giri/min, 37 ° C). Durante l’attesa per la cultura a crescere, preparare i supporti M63 con 1 x M63 sali, 1mm MgSO4, 0,2% glucosio, 0,1% casamino acidi e spectinomicina 50 μg/mL in acqua (garantire le parti costituenti sono sterili). Subdilute la cultura tardo-esponenziale-fase ad un rapporto di 1: 100 con media M63 completati con 50 spectinomicina μg/mL. Poi, introdurre la diluizione in una piastra di coltura di biofilm (ad es., dispensare il campione diluito in un piatto ben).Nota: I volumi richiesti per questo subdilution di 1: 100 dipendono dalla piastra di coltura utilizzato (ad esempio, se si utilizza una piastra ben 6 pozzetti polistirolo [non-tessuto-coltura trattata], un singolo campione richiederebbe aggiungere 20 μL di cultura a 2 mL di M63 + spec, come il volume standard ben di una piastra a 6 pozzetti è ~ 2 mL). Come i campioni sono pronti per l’illuminazione, nastro piastra di coltura al soffitto dell’incubatore, assicurando che la superficie nella parte inferiore del piatto è trasparente per l’illuminazione dal basso dal proiettore.Nota: È importante assicurarsi che il soffitto dell’incubatrice non è riflettente, per ridurre al minimo illuminazione randagi. Randagi illuminazione può anche essere ridotta utilizzando piastre con pareti nere come piastre di coltura, anche se questo non è strettamente necessario — se utilizza tali piastre, assicurarsi che la superficie inferiore è trasparente. Consentire il biofilm alla cultura nell’incubatrice durante la notte (16h con nessuna agitazione, a 37 ° C). Si noti che alcuni proiettori diventano meno affidabili a temperature più elevate. Se questo è il caso, cultura a temperature più basse (ad es., 30 ° C), tenendo presente che il tempo di incubazione potrebbe essere necessario essere aumentato, a seconda del ceppo di e. coli . 4. imaging modellato biofilm Dopo la crescita durante la notte dei campioni biofilm, rimuovere la piastra di coltura dall’incubatrice. Il piatto avrà biofilm batteri attaccati alla sua superficie inferiore dove esso è stato illuminato, come pure i batteri planctonici dispersi in mezzi liquidi sopra. Scartare le cellule planctoniche rimuovendo i mezzi liquidi dalla piastra di coltura (ad es., aspirando delicatamente con una pipetta). Sciacquare il campione 2 x con una soluzione di tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere le restanti cellule planctoniche (Figura 3B) pipettando delicatamente in PBS, seguita dall’aspirazione. Se le cellule sono fluorescente contrassegnate, immagine direttamente i campioni utilizzando la microscopia di fluorescenza13 (ad es., largo campo13, 3D confocale14, ecc.).Nota: Può anche essere conservato fluorescente biofilm utilizzando un mezzo di montaggio autotemperante. Applicare una goccia di montaggio supporto ad un campione di biofilm, coprire con un vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non per catturare qualsiasi bolle sotto e lasciare indurire una notte prima di formazione immagine. Se le cellule batteriche utilizzate non sono contrassegnate fluorescente, applicare il cristalvioletto macchia tecnica15 (Figura 3B) per aumentare il contrasto di biofilm prima di formazione immagine. 5. protocollo modifiche/alternative Crescere i batteri svevapacifico-Ag43 su diverse superfici. Mettere il vetro o poli-dimetil-silossano (PDMS) coupon (ad es., le lamelle o sottili strisce di PDMS) in piatti ben prima dell’aggiunta di un campione batterico/illuminazione e seguire lo stesso protocollo come prima per modello svevapacifico-ag43 biofilm su vetro e PDMS. Crescere batteri svevapacifico-Ag43 all’interno di un alloggiamento della coltura di trasparente, recintato. Generare uno stampo di camera di cultura per PDMS. Per una camera di cultura di base, è possibile generare muffa allegando un prisma rettangolare rigido a una superficie piana (il prisma diventerà una cavità nel PDMS che funge da camera di cultura una volta lo stampo viene eseguito il cast). Si noti che più intricate cultura camera stampi possono essere fabbricate utilizzando litografia soft16. Il cast di una cavità PDMS versando PDMS nello stampo e permettendo così di curare (per un protocollo dettagliato litografia soft, Vedi Science Education Database16 di JoVE). Dopo l’indurimento, tagliare qualsiasi eccesso PDMS, canali di ingresso/uscita del punzone nella camera di cavità/cultura e legare la cavità di una superficie piana (per esempio, vetro/polistirolo) premendo saldamente il PDMS su superficie piana, lasciando la cavità tra la superficie e il soffitto di PDMS come l’alloggiamento della coltura di biofilm.Nota: Incollaggio più permanente basato su plasma trattamento16 può essere utilizzato anche, ma poi il chip non sarà riutilizzabile. Seguire il protocollo di cultura come prima, usando una siringa con aghi a punta smussata (invece di una pipetta) per introdurre il campione batterico la cultura camera/sciacquare con tampone PBS (Figura 3). Se si utilizza una cavità temporaneamente incollata, utilizzare pressione negativa solo per tirare liquido in e out della camera, per garantire che la cavità non diventi unbonded dalla superficie del vetro/polistirolo sottostante. Crescere i batteri svevapacifico-Ag43 utilizzando una pellicola fotomaschere per illuminazione strutturata. Progettare un modello di biofilm utilizzando software CAD compatibile con un servizio di stampa/stampante photomask pellicola. Il design del film photomask dovrebbe essere chiaro nelle regioni dove il biofilm è destinato a essere stampato e nero/opaco altrove. Al termine, inviare il file di fotomaschere per il servizio di stampante/stampa e attendono il ritorno del fisico strato di fotoresist. Istruire il proiettore per illuminare un campo visivo completo con massima illuminazione blu (ad esempio, RGB = [0, 0, 255]) utilizzando software di computer portatile. Ritagliare una regione di interesse dal più grande pellicola photomask e nastro direttamente al fondo della cultura biofilm piatto prima di introdurre il campione batterico per l’illuminazione durante la notte (Figura 3D). Il biofilm della cultura come prima e rimuovere strato di fotoresist dopo la coltura, prima di formazione immagine.

Representative Results

Come visto in Figura 4A, batteri svevapacifico-Ag43 sono stati usati per generare biofilm modellato in piastre a pozzetti in polistirolo con illuminazione di proiettore (il proiettore è stato impostato per illuminare un reticolo di puntino di polka), ripreso attraverso microscopia in campo chiaro con il cristallo macchia viola come un agente di contrasto e la microscopia di fluorescenza usando batteri rosso-fluorescente–espressione della proteina. Campioni fluorescenti biofilm possono anche essere imaged mediante microscopia confocale14 per ottenere immagini del biofilm in 3-d (Figura 4B). In Figura 4, illustriamo la campitura alta risoluzione possibile utilizzando una pellicola fotomaschere per fornire illuminazione fantasia al campione di biofilm. Infine, in Figura 4 e 4E, dimostriamo esempi di patterning su vetro e superfici PDMS, nonché recintato PDMS cultura chambers — questi illustrano i diversi tipi di ambienti dove può essere applicato svevapacifico-Ag43 patterning. Figura 1: preparazione di batteri svevapacifico-Ag43 (protocollo sezione 1). Svevapacifico-Ag43 batteri in grado di formazione del biofilm luce-ha regolato la preparazione comprende purificazione del plasmide svevapacifico-Ag43 da un host clonazione ceppo, trasformandolo in un ceppo di e. coli di interesse e la creazione di stock con freezer batterica a lungo termine deposito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: preparazione di un set-up ottico per l’illuminazione del campione di biofilm (protocollo sezione 2). Il set-up ottico è ospitato all’interno di un incubatore batterico e si compone di un proiettore collegato a computer illuminando un campione di biofilm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: cultura protocollo per patterning biofilm (protocollo sezione 3). (A) prima dell’illuminazione, svevapacifico-Ag43 batteri sono preparati prima patterning tale che siano indotti in modo affidabile nella fase di crescita corretta. (B) dopo una notte illuminata di crescita, un biofilm fantasia sarà presente nella parte inferiore della piastra di coltura, insieme con le cellule planctoniche in mezzi liquidi, e dopo qualche ulteriore trasformazione, il biofilm è pronto per l’imaging. (C) in alternativa a bene piastre, biofilm possono essere coltivati in camere di cultura chiusa come una cavità PDMS modellata. In questo caso, siringhe attaccati agli aghi punta smussata utilizzabile per introdurre il campione e lavare liquidi fuori dalla camera. (D) come alternativa a modelli di illuminazione basati su proiettore, modelli possono essere generati anche con nastro adesivo pellicola fotomaschere direttamente alla parte inferiore degli alloggiamenti di cultura del biofilm. In questo caso, il proiettore deve essere impostare per illuminare di luce blu attraverso il campo completo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: risultati rappresentativi dei biofilm modellato utilizzando svevapacifico-Ag43. Tutti i risultati sono stati ottenuti utilizzando un ceppo di host MG1655 Escherichia coli . Batteri svevapacifico-Ag43 (A) sono stati usati per generare i biofilm modellati in piastre a pozzetti in polistirolo con illuminazione di proiettore (il proiettore è stato impostato per illuminare un reticolo di puntino di polka), ripreso attraverso microscopia in campo chiaro con cristalvioletto macchia come un agente di contrasto e microscopia di fluorescenza usando batteri rosso-fluorescente–espressione della proteina. (B) fluorescente biofilm campioni sono imaged con microscopia confocale per ottenere immagini 3D del biofilm. (C) ad alta risoluzione biofilm può essere modellato con una pellicola fotomaschere per fornire illuminazione fantasia al campione di biofilm. I biofilm (D) possono essere modellati su vetro e superfici PDMS. I biofilm (E) possono essere modellati in alloggiamenti chiusi cultura. Questa figura è stata adattata da precedente lavoro3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Problema Possibili cause/soluzioni Trasformare svevapacifico-Ag43 in ceppo di host – nessun colonie Bassa concentrazione di plasmide – controllare la concentrazione di plasmide su spettrometro. Un tipico miniprep di svevapacifico-Ag43 dovrebbe dare almeno 100 ng/μL; utilizzare fino a 10-100 ng per trasformazione Controllo/remake cellule competenti: cellule competenti dovrebbero avere efficienza di trasformazione almeno 10 ^ 6 cfu / µ g verificata utilizzando un plasmide standard come pUC19 – se non, cellule competenti remake Antibiotico sbagliato (livello di) sulla piastra di agar LB – assicurarsi di utilizzare 50 spectinomicina μg/mL per la selezione Illuminazione del proiettore si trasforma off / incoerente durante la notte Disattivare il software problematico come: l’aggiornamento software/OS automatico durante la notte, filtro di luce blu notte-tempo Potrebbe essere il surriscaldamento proiettore – set incubatore a bassa temperatura mentre il proiettore è acceso (ad es. 30 ° C invece di 37 ° C) – proiettore nota come fonte di calore può surriscaldarsi incubatore punto impostato Rimuovere inutili fonti di umidità dall’incubatrice, come possono interessare elettronica proiettore No/basso livelli di biofilm formano dopo illuminazione durante la notte, nessuna crescita di cellule planctoniche o (cioè liquido è chiaro) Antibiotico sbagliato (livello di) – assicurarsi di utilizzare 50 spectinomicina μg/mL Controllare che tutto è aggiunto alla ricetta M63 correttamente No/basso livelli di biofilm formano dopo una notte illuminazione, solo le cellule planctoniche (cioè liquido è torbido) Controllare luce livello, proiettore dovrebbe essere illuminante luce blu a 50 μW/cm ^ 2 a 460 Nm Prova lasciando batteri di crescere più corto/lungo dopo 1: 1000 LB passo di subdilution prima dell’aggiunta a M63 Restreak batteri sulla piastra LB, a partire da Colonia fresca per generare la fase stazionaria durante la notte cultura Garantire il proiettore sta lavorando costantemente durante la notte – vedere punto precedente Modelli di biofilm fuzzy, alti livelli di rumore di fondo Ridurre la luce diffusa dal sistema di illuminazione ottica, coprire superfici riflettenti interno dell’incubatrice Considerare l’utilizzo di illuminazione strutturato basato su photomask (al contrario di proiettore-basato) Controllare il proiettore è correttamente a fuoco sulla superficie di fondo della camera di cultura del biofilm Tabella 1: Comune risoluzione dei problemi.

Discussion

Alla luce dell’esigenza di strumenti di ricerca che consentono il controllo di struttura del biofilm, abbiamo presentato un protocollo di easy-to-use per patterning biofilm batterici utilizzando il costrutto di optogenetica svevapacifico-Ag43. Con questa tecnica, e. coli biofilm può essere otticamente basato su vari ambienti di superficie, comprese le camere chiuse, con una risoluzione spaziale inferiore a 25 μm.

Nel complesso, questo protocollo può essere suddiviso in quattro sezioni principali: (1) la preparazione dei batteri svevapacifico-Ag43, (2) la preparazione di ottica e cultura set-up hardware, (3) la procedura di pre-illuminazione la crescita batterica e (4) post-l’illuminazione risciacqui e imaging.

La parte critica della sezione 1 è la trasformazione di successo del plasmide svevapacifico-Ag43 nel ceppo di e. coli di interesse. Questo è facilitato dal plasmide purificato di alta qualità di isolamento e di generare cellule competenti di alta qualità per la trasformazione (tabella 1, risoluzione dei problemi).

La parte critica della sezione 2 è l’ottimizzazione dell’assetto proiettore in modo che l’intensità di illuminazione è regolato a 50 μW/cm2 alla lunghezza d’onda di 460 nm, e il proiettore è correttamente a fuoco all’altezza del campione di biofilm. Si noti che in questo protocollo, descriviamo un assetto invertito illuminazione dove il proiettore brilla luce dal basso, verso l’alto verso il campione di biofilm. Il vantaggio di questo set-up è che la luce ha bisogno solo di viaggiare attraverso il fondo della piastra di coltura prima di raggiungere la superficie di formazione del biofilm. Illuminazione dall’alto significa che la luce avrebbe dovuto viaggiare attraverso mezzi liquidi sopra la superficie del biofilm, che, nel corso della crescita, diventa torbida con cellule planctoniche. Oltre a queste preoccupazioni, è anche importante minimizzare la stray light nella confi gurazione di ottica per quanto possibile, ad esempio, mediante la copertura di superfici riflettenti all’interno dell’incubatore — Questo aiuta a ottenere più nitida a motivi biofilm. In una nota correlata, più nitida biofilm modelli possono anche essere ottenuti utilizzando un photomask per controllare il modello di illuminazione (Figura 3D, Figura 4). Problemi comuni che richiedono la risoluzione dei problemi comprendono problemi di affidabilità del proiettore alle temperature elevate (ad es., 37 ° C), che possono essere minimizzate incubando la crescita di biofilm a temperature più basse (ad es., 30 ° C), oltre a software per computer che causa di aggiornamenti del sistema operativo o luce blu filtro durante la crescita durante la notte (tabella 1). È anche importante notare che, a seconda del modello di proiettore e incubatore utilizzato, è anche possibile che il calore generato dal proiettore si tradurrà in un’ più alta temperatura interna che l’incubatrice impostata temperatura, che potrebbe essere necessario essere corretto.

La parte critica della sezione 3 è l’ottenimento di campioni batterici affidabili e ripetibili prima che siano indotti da illuminazione. Per questo motivo, è consigliabile ottenere clonale colonie di batteri svevapacifico-Ag43 striature fuori su una piastra di agar e quindi utilizzando la procedura di coltura liquida per garantire che i batteri siano illuminati/indotta nella fase di crescita esponenziale tardiva in un ripetibile modo.

Infine, la parte critica della sezione 4 è quello di fondo, ma anche delicatamente, lavare via le cellule planctoniche restanti dopo il biofilm patterning protocollo; Pertanto, si consiglia di eseguire più passaggi di risciacquo delicato con PBS.

Rispetto alle tecniche esistenti per cella patterning5,6, ottico biofilm patterning basata su svevapacifico-Ag43 ha una ragionevolmente bassa barriera di ingresso da utilizzare, in quanto non necessita di microfabbricazione, pulire-camera, complesso chimica, o pretrattamento superficiale, eppure è ancora in grado di modello con l’alta risoluzione (25 μm) tipicamente associato con tecniche di microfabbricazione. Il metodo estende precedente lavoro su fotolitografia batterico per il controllo di espressione genica17. Attualmente, svevapacifico-Ag43 plasmide è limitato a e. coli, come utilizza una base di pUC origine di replicazione, ma svevapacifico e Ag43 sono entrambi compatibili in altre specie batteriche (Gram-negativi). Tecniche genetiche sono disponibili per l’introduzione di formazione di biofilm luce-regolata per diverse specie batteriche potenzialmente e rappresenta una possibile direzione per la ricerca futura. Un’altra potenziale limitazione della tecnica è che funziona aumentando la formazione di biofilm in ceppi con formazione di biofilm nativo debole (ad es., MG1655 Escherichia coli). Tuttavia, ceppi con formazione del biofilm nativo forte hanno forma di biofilm indipendentemente dalle condizioni di illuminazione, precludendo la formazione di biofilm modellato utilizzando svevapacifico-Ag43 come descritto qui; ancora optogenetica tecniche possono ancora risultare applicabile nella regolazione della formazione di biofilm. Notiamo che in altri contesti, metodi alternativi di biofilm patterning potrebbero essere disponibili, ad esempio via ottica c-di-GMP modulazione18.

Nel complesso, svevapacifico-Ag43 basata di patterning sarà appropriato per l’utilizzo in applicazioni che studiare l’effetto della struttura del biofilm su funzione1 e, pertanto, potrebbero beneficiare di controllo sintonizzabile su biofilm patterning — una particolarmente rilevante esempio per evidenziare è lo studio dell’ecologia microbica in biofilm2. Orientamenti futuri includono rendendo biomateriali fantasia8,9 e/o strutturata comunità batteriche. Applicazioni alternative del presente protocollo accessibile includono anche bio-arte19, dato il potenziale estetico chiaro, come pure la scienza di vita formale e informale formazione20,21,22. Da un punto di vista didattico, il protocollo descritto qui combina molte tecniche pertinenti (coltura batterica, trasformazione, ottica/optogenetica) ed è anche modularmente estensibile (ad esempio, includere microfluidica).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano vetro D., H. Kim, N. Cira, Choksi r., Rossi S. e B. chiavi per loro utili suggerimenti e il laboratorio di Spormann per l’accesso ai loro microscopio confocale. Inoltre, gli autori riconoscono il supporto da Stanford Bio-X Bowes e NSERC PGS borse di studio, il National Institute of Health (R21-AI-139941) e l’American Cancer Society (RSG-14-177-01).

Materials

DH5alpha/pDawn-Ag43 Addgene 107742 DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use
MG1655 E. coli Coli Genetic Stock Center – Yale University CGSC #6300 MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results
RFP expression plasmid iGEM biobricks J04450-pSB4K5bb Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43
Plasmid miniprep kit Qiagen 27104
LB broth powder Affymetrix 75852 Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec
LB agar powder Affymetrix 75851 Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates
Petri dishes Fisherbrand 431760
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate abcam ab141968 Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol
M63 media salts 5X solution Bio-world 705729 Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water
Casamino acids Amresco J851 Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%)
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%)
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM)
Crystal violet  Acros organics 212120250 Dilute to 0.1% in water prior to use
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) Thermo Scientific 9990402 Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging
Phosphate buffered saline (PBS) solution  Gibco 10010023 Can also use PBS prepared from powder / tablets
6 well plate Fisherbrand 351146 Used as biofilm culture dish for representative results
PDMS kit Dow SYLGARD 184 Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography
1 mL syringe BD syringe 309659 For use with liquid handling with enclosed microchambers
Blunt tip needle CML supply 901-23-050 Attaches to 1 mL syringe
Lab tape Fisherbrand 15-901 Use to attach culture chamber to incubator ceiling
Bacterial incubator Sheldon Manufacturing SMI6 Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling
Portable projector Ivation IV-PJ-PRO-4-1 Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength
Optical breadboard base ThorLabs MSB6 Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards
Optical post ThorLabs TR8 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp
Optical post right-angle clamp ThorLabs RA90 Connects vertical and horizontal posts
Mounting base ThorLabs BA1S Connects optical breadboard base and vertical post
1/4"-20 screw ThorLabs SH25S050 Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base
1/4"-20 set-screw ThorLabs SS25E63D Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole
Optical power meter Newport 840 Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement
Optical power meter detector Newport 818-UV Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range
Adjustable ND filter K&F Concept SKU0689 Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture
Presentation-projector software Microsoft Powerpoint Any software that allows drawing / presentation will suffice
CAD software Autodesk  AutoCAD Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files
Film photomask Fineline Imaging n/a Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing
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References

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Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43. J. Vis. Exp. (140), e58625, doi:10.3791/58625 (2018).
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