Высоким разрешением узорной биопленки осаждения с pDawn-Ag43

1. Подготовка pDawn-Ag43 штаммов бактерий PDawn-Ag43 Превратите штамм E. coli интерес (рис. 1). Расти штамм клонирования, хостинг плазмида pDawn-Ag43 (доступный из репозитория плазмида) путем прививки штамм в LB отвара дополнена 50 мкг/мл спектиномицин (LB + спецификации) в трубу культуры (ночевка в тряску инкубатор на ~ 250 об/мин, 37 ° C). Затем используйте набор алкалический урожай плазмида очищенный pDawn-Ag4310. Выберите штамм E. coli интерес к быть сделанный по образцу. До сих пор было проверено pDawn-Ag43 для работы в MG16553 и BW25113. Использовать протокол для создания компетентных (например, химически компетентным11 или12electrocompetent) запасов выбранного штамм E. coli (например, MG1655). Трансформировать плазмида pDawn-Ag43 в компетентные бактерий11,12, следуют восстановления 1 h и пластины на LB + плиты спектра агара. Разрешить колоний расти на ночь при 37 ° C. Магазин pDawn-Ag43 преобразован штаммов. Прививок одной колонии pDawn-Ag43 от фунтов + спец плита агара в LB + спец бульон в трубке культуры и расти в тряску инкубатора (на ~ 250 об/мин, 37 ° C) для экспоненциальной фазе (OD600 ~0.4 – 0,8). Подготовьте складе для хранения штамм pDawn-Ag43 превращается в-80 ° C долгосрочный, смешивая 1 мл культуры с 1 мл 50% стерильный глицерина в крио трубка для получения 25% глицерина морозильник складе. Храните это в морозильной камере-80 ° С. Если дополнительные плазмид (например, флуоресцентный репортер плазмид) должны быть преобразованы, создание компетентных клеток11,12 от pDawn-Ag43 превращается деформации и повторите процесс трансформации11 , 12 для дополнительных плазмид, по мере необходимости.Примечание: Если с помощью электропорации8, возможна cotransform несколько плазмидов (включая pDawn-Ag43) одновременно; Однако одновременное преобразование не рекомендуется использование методов химического преобразования, как большой размер (> 10 КБ) pDawn-Ag43 означает, что уменьшается эффективность преобразования. 2. Подготовка Set-up оптический проектор для освещения бактерий Получения бактериальной инкубатор с непрозрачными стенами и отверстие для передачи кабели, портативный проектор, способных установки и функционирования внутри бактериальной инкубатора, и ноутбук оснащен программным обеспечением для презентации проекции (см. таблицы Материалы). При выборе проектора и инкубатор, убедитесь, что это меньше, чем внутренняя высота инкубатора расстояние минимальный фокусировки проектора. Расположить проектор внутри инкубатора внизу, с апертурой указывая прямо вверх, на потолок, где находится камера культуры биопленки прилагается (рис. 2). Исправление, проектор в месте, создав set-up с оптическим макет базового подключен к вертикальной пост, в свою очередь подключены к горизонтальной пост какие винты в проектор (рис. 2). Обратите внимание, что эта настройка может быть изменен в зависимости от проектор/доступных частей. В конечном счете ключевым требованием является, что проектор прочно фиксируется в нижней части инкубатора, с диафрагмой, указывая вверх. Подключите ноутбук через кабель дисплея (например, HDMI) к проектору внутри инкубатора. Если поверхности — особенно потолок — внутренних дел инкубатора являются Светоотражающий (например, полированной поверхности металла), накрыть их темные матовые поверхности, чтобы свести к минимуму размышления. Используйте ленту для присоединения пустой «Макетные» культуры блюдо к потолку инкубатора. Обратите внимание, что, как с проектором, есть несколько приемлемых способов приложить культуры блюдо; Убедитесь, что поверхность прозрачной нижней палаты культуры, где происходит освещение, не покрыта. Отрегулируйте фокус на проекторе, поворачивая ручки фокусировки, так что плоскости фокусировки совпадает с нижней поверхностью биопленки культуры блюдо (например, хорошо пластины) прикреплены к потолку инкубатора (рис. 2). Проектор должен осветить резкий, не размытые изображения на нижней части культуры блюдо. Удалите «Макетные» культуры блюдо после того, как проекция была оптимизирована. С помощью программного обеспечения ноутбук, прямые проектор для освещения полное поле зрения с максимальной синей подсветкой (например, RGB = [0, 0, 255]), представляя полный синий слайд. Измерьте интенсивность подсветки проектор, используя Измеритель оптической мощности, поместив головку фотоприемника в инкубатор потолок и чтения интенсивности на соответствующей мощности метр калиброван легкие волны 460 Нм. Следуйте инструкциям по подключению и калибровке Фотоэлемент для конкретных ваттметр используется. Уменьшения освещенности (например, выключить свет номер, или разместить инкубатор вдали от источников света) насколько это возможно, до принятия измерения интенсивности освещения. Регулировать интенсивность освещения, с помощью регулируемой нейтральной плотности фильтра размещены на проектор диафрагмы. Поверните фильтр для регулировки освещенности измеряется измеритель мощности, до тех пор, пока интенсивность освещения в центре региона прогнозируемых синий свет читает 50 мкВт/см2.Примечание: Хотя это можно регулировать интенсивность освещения с помощью нижней голубой RGB-значений на конце программного обеспечения, используя фильтр, в то время как максимальное значение синий RGB имеет преимущество максимального оптического контраст системы между освещенной vs. темные области. Рисовать произвольные шаблоны, используя программное обеспечение презентации/проектор на ноутбуке и отображать эти шаблоны на потолке инкубатора, с использованием проектора.Примечание: Биопленки формирование регионов следует использовать с максимальной синей подсветкой (например, RGB = [0, 0, 255]), не образуя биопленки регионов с без подсветки (например, RGB = [0, 0, 0]). 3. культивирование узорной биопленки До освещения Подготовьте pDawn-Ag43 бактерий, начиная от глицерина морозильник акций, таким образом, чтобы они надежно индуцированной в конце фазы экспоненциального роста для освещения (рис. 3A). Полоска из глицерина запасов на LB + плиты спектра агара штамм pDawn-Ag43. Разрешить колоний расти на ночь (37 ° C).Примечание: Здесь до освещения культуры шаг, убедитесь, клетки остаться в темноте как можно больше — короткие периоды на окружающего освещения (например, для subdilution) являются приемлемыми. Прививок колонии pDawn-Ag43 бактерий из агар пластины в LB + спец бульон и расти культура на ночь для стационарной фазы (в тряску инкубатор ~ 250 об/мин 37 ° C, ~ 16 ч). Subdilute культура в соотношении 1:1,000 с LB + спец бульон (например, добавить 1 мкл ночь культуры в 1 мл свежего LB + спецификации). Разрешить subdiluted культуры расти до конца экспоненциального/начале стационарной фазы (ОД ~ 1.0, ~ 6 h в тряску инкубатор на ~ 250 об/мин, 37 ° C). Время ожидания для культуры расти, подготовить M63 СМИ с 1 x M63 соли, 1 мм MgSO4, 0,2% раствор глюкозы, 0,1% casamino кислот и спектиномицину 50 мкг/мл в воде (обеспечение составные части стерильны). Subdilute конце экспоненциальной фазе культуры в соотношении 1: 100 с M63 СМИ дополнена 50 мкг/мл спектиномицину. Затем ввести разрежения в биопленки культуры блюдо (например, Пипетка разреженных образца в хорошо плиту).Примечание: Объемы, необходимые для этого масштаба 1: 100 subdilution зависит от культуры блюдо используется (например, при использовании полистирола 6-Ну хорошо плиты [не ткани Культура лечение], один образец потребует добавления 20 мкл культуры 2 мл M63 + спецификации, как Стандартный хорошо объем 6-ну плиты составляет ~ 2 мл). Поскольку образцы теперь готовы для освещения, лента культуры блюдо к потолку инкубатора, обеспечивая что поверхность в нижней части блюдо является прозрачным для освещения снизу проектора.Примечание: Это важно для обеспечения того, чтобы потолок инкубатора не отражающей способностью, чтобы свести к минимуму бродячих освещения. Бродячих освещения можно также уменьшить, используя черный стенками пластин как культура блюда, хотя это не является строго необходимым — если с помощью таких плит, обеспечить нижней поверхности является прозрачным. Разрешить биоплёнки к культуре в инкубаторе на ночь (16 h с не встряхивания, при 37 ° C). Обратите внимание, что некоторые Проекторы становятся менее надежными при более высоких температурах. Если это так, культуры при более низких температурах (например, 30 ° C), имея в виду, что время инкубации может потребоваться увеличить, в зависимости от штамма кишечной палочки . 4. изображений узорной биопленки После ночи роста образцов биопленки удалите культуры блюдо из инкубатора. Блюдо будет иметь биопленки бактерий, прилагается к его нижней поверхности, где он осветил, а также планктонных бактерий, диспергированных в жидких средах выше. Выбросите планктонных клетки путем удаления жидких сред из культуры блюдо (например, от нежно аспирационных с пипеткой). Промойте образца 2 x с раствором фосфат амортизированное saline (PBS), чтобы удалить оставшиеся планктонных клеток (рис. 3B), осторожно дозирование в PBS, следуют аспирации. Если клетки дневно меткой, непосредственно изображения образцов с помощью флуоресцентной микроскопии13 (например, поля13, 3-D конфокальный14, и т.д.).Примечание: Флуоресцентные биоплёнки могут также сохраняться с помощью ЖСС монтажа средних. Нанесите одну каплю монтажа СМИ образец биопленки, накрыть стеклянной coverslip, стараясь не захватить любые пузыри под и позволить ему затвердеть на ночь перед изображений. Если используются бактериальные клетки не помечены дневно, примените Фиолетовый Кристалл пятно техника15 (рис. 3B) для повышения контраста биопленки до изображений. 5. Протокол изменений/альтернативы Растут pDawn-Ag43 бактерий на различных поверхностях. Стекла или поли диметил силоксановые (PDMS) купоны (например, coverslips или тонкой полоски PDMS) в хорошо пластины перед добавлением бактериальной образца/освещение и следить за тот же протокол как раньше для модели pDawn-ag43 биопленки на стекле и PDMS. Растут pDawn-Ag43 бактерий внутри культуры транспарентного, замкнутые камеры. Создания плесени палаты культуры для PDMS. Основные культуры камеры генерировать формы Подключив жесткий, Прямоугольные призмы к плоской поверхности (призму станет полости в PDMS, который служит в качестве палаты культуры после литые формы). Обратите внимание, что более сложные формы палаты культуры могут быть изготовлены с помощью мягкой литографии16. Литой PDMS полости, наливая PDMS в плесень и позволяя его вылечить (протокол подробный мягкой литографии, см. в JoVE на науки образования базы данных16). После отверждения, обрезать любой избыток PDMS, punch впускных/выпускных каналов в камеру полости/культура и облигаций полости на плоской поверхности (например, стекло/Полистирол) с усилием нажать PDMS на плоскую поверхность, оставляя полости между поверхностью и PDMS потолок в зале культуры биопленки.Примечание: Можно также использовать более постоянного связывания на основе плазменной обработки16 , но затем фишки не будет повторно. Следуйте протоколу культуры, как прежде, используя шприц с тупым кончик иглы (вместо пипетки) ввести бактериальных образца в культуре камеры/полоскания с PBS буфера (рис. 3 c). Если временно кабального полости, используйте только отрицательное давление тянуть жидкости в сутки камеры, обеспечить что полости не стали несвязанных от подстилающей поверхности стекла/полистирол. Растут pDawn-Ag43 бактерий с помощью фильм фотошаблонов для структурированного освещения. Дизайн-шаблон биопленки, с использованием САПР совместимы со службой печати принтер photomask фильм. Photomask фильм дизайн должны быть ясными в регионах, где биопленки предназначен для печати и черный/непрозрачный других. Когда заполните, отправьте файл photomask обслуживание принтера/печати и ждать возвращения физического photomask. Поручить проектор для освещения полное поле зрения с максимальной синей подсветкой (например, RGB = [0, 0, 255]) с помощью программного обеспечения ноутбук. Вырежьте из региона интерес со стороны крупных photomask фильм и ленты, он прямо к нижней части биопленки культуры блюдо перед представляя бактериальных образца для ночного освещения (рис. 3D). Культура биоплёнки как раньше и удалить photomask после культивирования, до изображений.