文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング

1. STAgR 戦略をクローニングの設計 どのように多くの gRNA のカセットが別途 1 発現ベクターとその順序を決定します。プロモーターと gRNA を決定する、gRNAs のそれぞれに使用する足場。オンライン ツール (例えばwww.benchling.com) を使用して、gRNAs をデザインします。 2. STAgR のオーバー ハングが付いているプライマーをクローニングの設計 注: 最初の gRNA のアンチセンスと最後の gRNA の意味 protospacer シーケンスそれぞれに追加されますベクター バックボーン (図 1) の増幅用プライマー。センスとアンチセンス gRNAs を目的の順序に取り付ける、文字列から残りのシーケンスが増幅されます。最初の文字列部分はオーバー ハングとして N20 シーケンスの最初の gRNA を含む前方プライマーとオーバー ハングと N20 シーケンス (逆の補数) の 2 番目の gRNA と逆プライマー増幅されます。それに応じて、すべての次の部分が生成されます。 (表 1) をオーバー ハングと同様の STAgR DNA 文字列の前方増幅プライマーに N20 gRNA シーケンスを追加します。(従来の足場) の前方プライマー”scf FP”または”サム FP”(MS2 含む足場) のために感覚の gRNA シーケンス 5′ を追加します。FP プライマーをアニール足場/MS2 部にそれぞれの STAgR 文字列 (図 1)。 逆の補数 N20 gRNA シーケンスを逆プライマー シーケンスに追加します。特定のプロモーターと使用される文字列 (hU6 RP、mU6 RP、H1 RP 7sK RP) に応じて RP プライマーを選択します。 3. STAgR の断片をクローニングの世代 ギブソン アセンブリの個々 のクローンのフラグメントを生成する高忠実度 (HF) バッファー、10 mM の dNTPs の 1 μ L、オーバー ハング-プライマー (100 μ M)、10 の 0.25 μ L の 10 μ L を設定して Pcr を行う DNA テンプレート (文字列またはベクトル)、0.5 μ L HF のポリメラーゼの ng、ジメチルスルホキシド (DMSO) 1.5 μ H2O に 50 μ L の最終巻を追加。注: SAM 足場を選択した場合、バックボーン PCR の最後の gRNA に gRNA の足場を組み込むプラスミド”STAgR_Neo”をテンプレートとして使用、「STAgR_SAM」を使用。6 gRNA カセット STAgR プラスミッドのためたとえば、6 Pcr、dna 5 文字列テンプレートおよびテンプレートとしてベクター バックボーンを持つものとして、必要に応じて。 次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 1 分 30 秒; 98 ° C の 1 サイクル38 サイクル 98 ° C の 10 s、59 ° C (gRNA 足場)/68 ° C (サムのループ) の 10 s、30 のための 72 ° C (挿入) の s/1 分 30 s (ベクトル); 用10 分の 72 ° C の 1 サイクル。 PCR の反作用から 5.5 μ L を削除、読み込み染料を追加し、1% アガロースゲル上増幅断片を分析します。負荷 (100 bp DNA ラダー/1 kb DNA ラダー) のサイズと適切なゲルの実行中におけるゲルの実行の適切な DNA ラダー 120 V で 30 分間のバッファー (例えば、TLE バッファー)。 ゲルを実行すると、バッファーの制限の酵素と 0.5 μ L の 5 μ L を追加DpnI (10 単位) 残り 44.5 μ L の PCR 反応し 1 時間に 37 ° C で 30 分間インキュベート 磁気ビーズを用いた DNA の浄化を実行します。 PCR の製品の 1 μ L あたり 1.8 μ L 磁気ビーズを追加し、上下ピペッティングで混ぜます。部屋の温度 (RT) で 2 分間インキュベートします。 磁石の残留液体からビーズと DNA のフラグメントを分離します。完全に再することがなく、ペレットを洗浄によってビード 70% エタノールで 2 回洗浄しなさい。 ピペットとすべてエタノールを外し、ペレット空気が乾燥してみましょう。 ピペッティングを上下で 15-20 μ L H2O のペレットを溶かし、磁石を使用して液体からビーズを分離します。クリアの上清を新しいチューブに転送します。注: また、列に基づく反応クリーン アップ キットも使用できます。 29を他の場所で説明されているように分光光度計を使用して DNA の濃度を決定します。 4. ギブソン アセンブリ反応や細菌変換 メモ: 次の手順は、ギブソンらから適応30。 反応ミックスまたは商業ギブソン クローニング キットを使用して自家製のギブソンを準備します。 1 M トリス (トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン) の 3 mL を組み合わせる-pH 7.5、1 M MgCl 100 mM dGTP (デオキシグアノシン三リン酸) 60 μ L、100 mM dATP (デオキシアデノシン三リン酸) 60 μ L、100 mM dTTP (チミジン三リン酸) 60 μ、100 mM dCTP (60 μ L 300 μ L で HClデオキシシチジン三リン酸塩)、1 M DTT (ジチオトレイトール)、ペグ-8000 (ポリエチレング リコール)、100 mM NAD の 300 μ L (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド) の 1.5 g の 300 μ L H2O 6 mL の 5 × の等温の反作用バッファーを取得するを追加します。注: 検体のバッファーは-20 ° C で少なくとも 12 ヶ月間保存できます。 ギブソン アセンブリ マスター ミックス、5 x の等温の反作用バッファーの 320 μ L を組み合わせて 697 μ H2O および 10 U/μ L T5 exonuclease の 3 μ L、2 U/μ L の DNA ポリメラーゼの 20 μ L、40 U/μ L Taq DNA リガーゼの 160 μ L を追加します。注: このミックスは、少なくとも 12 ヶ月間、避けようと-20 ° C で保存されますを使用できます。 挿入およびベクトルの 2.5 μ L でアセンブリのマスターの組合せの 7.5 μ L を使用します。2 x STAgR 反応全 DNA の 1:1 がない以上 0.2 pmol の比率を挿入するのにモル ベクトルを使用します。以上 2 gRNA 式カセット、ベクトルを使用して、1:3 の比率を挿入するが、0.5 pmol の総 DNA の量を超えていません。注: すべての増幅 gRNA 式カセットは、等モル量で使用ください。ベクトルが未消化のテンプレート ベクトル (または自己 ligation) 用のコントロールに挿入しますと同一の額でプラスミド コントロールを含めます。 氷の上に 60 45 分ストア サンプルの 50 ° c または-20 ° c 後続の変換のためのサンプルをインキュベートします。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 直接化学的に有能な細菌にミックスの半分を変換します。 雪解けの氷の上の化学的に有能な TOP10エシェリヒア属大腸菌細菌。 有能な細菌の 50 μ L にギブソン ミックスの 5 μ L を追加します。管の底をフリックで優しく混ぜます。氷上で 30 分間インキュベートします。 42 ° C の水浴または 45 のヒート ブロックにチューブを配置することでヒート ショックを実行 s。 氷に戻ってチューブを置きます。細菌に 250 μ L の SOC 培地を追加し、30-45 分の揺れのインキュベーターで 37 ° C で回復できるようにします。 回復後、プレートのアンピシリンを含む 1.5% ホストゲノム スープ (LB) 寒天プレートの上に変換された細菌 (100 μ g/mL) し、37 ° C で一晩インキュベート 5. 細菌のコロニー PCR による STAgR クローンを選択します。 同じラベルを各構成要素の 200 μ L PCR の反作用の管 (3 と 24) の間の少なくとも 2 つのセットを準備します。 100 μ g を含む 100 μ L LB 培地で 1 つのセットを埋める/mL アンピシリン。 細菌コロニーの生物材料オフにスクラッチする滅菌ピペット チップを使用して、空の 100 μ L の PCR 反応管の下部に 。すぐに先端を LB 培地を含む 2 つ目の対応する反応管に転送します。 細菌のいくつかは, 後で使用のための 37 ° C で、LB メディアへ転送を確保するため周辺チップを軽く旋回します。 PCR マスター ミックス (反応あたり 10 μ L) を設定します。 10 反応のプライマー (100 μ M)、 Taqのポリメラーゼの 0.5 μ L の 0.5 μ L、2 μ L 10 mM dNTPs 10 μ L Taqバッファーを結合し、H2O を 100 μ L のボリュームに追加します。 次のプライマーを使用して、: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG、StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG。 LB メディアなしラベル PCR の反作用の管に 10 μ L の PCR マスター ミックスを追加します。 次の条件を使用してたちの反応を孵化させなさい: 94 ° C の 5 分の 1 サイクル 30 94 ° c 38 サイクル s、55 ° C、30 秒、2 分; 72 ° C10 分の 72 ° C の 1 サイクル。注: gRNA 式カセット数と伸長時間 (72 ° C ステップ) を増やす必要があります。挿入テーブル 2を使用しての理論的なサイズを計算し、72 ° c. で 1 kb あたり 1 分を使用 ローディングの染料を追加し、1% の agarose のゲルに増幅されたフラグメントを分析します。サイズ変更のための適切な DNA の梯子を読み込む (1 kb DNA ラダー) 30 分間 120 V でバッファー (例えば、TLE バッファー) を実行するの適切なゲルを実行し、。 使用されるプロモーター、gRNA 足場と N20 シーケンスの数の個々 のサイズを追加することにより表 2の助けを借りて、私アンプリコンの理論上のサイズを計算します。コロニー PCR の結果から正しいバンドのサイズと正しいベクトルを抱く可能性があるかどうかに基づいて細菌のクローンを識別します。 以前の設定、対応する 100 μ L 文化 (100 μ g/mL アンピシリン) と 2.5 mL 一晩 LB 文化を接種します。12 h の 37 ° C で孵化させなさい。 商業プラスミド ミニ キットと31の製造元の指示を使用してプラスミッド DNA を抽出します。 次のプライマーを使用してプラスミッド シーケンス: サンガーの配列によって StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG)、StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG)。