Un protocollo personalizzabile per String Assembly gRNA clonazione (STAgR)

1. design di STAgR clonazione strategia Decidere su quanti gRNA cassette sarà inclusi nel vettore di espressione e in quale ordine. Determinare quali promotori e gRNA ponteggi devono essere utilizzati per tutte le gRNAs. Progettare il gRNAs utilizzando qualsiasi strumento online (ad esempio, www.benchling.com). 2. design di STAgR clonazione primer con sporgenze Nota: La sequenza di protospacer senso dell’ultimo gRNA e antisenso del primo gRNA rispettivamente vengono aggiunti per gli iniettori PCR usati per l’amplificazione del backbone vettoriale (Figura 1). Le sequenze rimanenti sono amplificate dalle stringhe, quindi associare il senso e antisenso gRNAs nell’ordine desiderato. La prima stringa pezzo è amplificato con un primer forward contenente il primo gRNA N20 sequenza come una sporgenza e un primer inverso con la seconda gRNA N20 sequenza (complemento inverso) come una sporgenza. Tutti i pezzi seguenti vengono generati di conseguenza. Aggiungere N20 gRNA sequenze i primer di amplificazione in avanti per stringa STAgR DNA come sporgenze (tabella 1). Aggiungere senso gRNA sequenze 5′ al primer forward “scf-FP” (per un ponteggio convenzionale) o “sam-FP” (per un ponteggio contenente MS2). Primer FP tempri la parte di ponteggio/MS2 della relativa stringa STAgR (Figura 1). Aggiungere il complemento inverso N20 gRNA sequenza le sequenze dell’iniettore inversa. Scegliere primer RP a seconda dei promotori specifici e stringhe utilizzate (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP). 3. generazione di STAgR clonazione di frammenti Per generare i singoli frammenti clonazione per assemblaggio di Gibson, eseguire PCRs impostando 10 µ l di tampone di alta fedeltà (HF), 1 µ l di 10 mM dNTPs, 0,25 µ l di sporgenza-primer (100 µM), 10 ng della polimerasi del DNA modello (stringa o vettoriale), 0,5 µ l HF , 1,5 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) e aggiungere H2O per rendere un volume finale di 50 µ l.Nota: Utilizzare il plasmide “STAgR_Neo” come un modello per la spina dorsale PCR per incorporare gRNA patibolo per l’ultimo gRNA, se SAM Scaffold viene scelto, utilizzare “STAgR_SAM”. Per un plasmide STAgR con sei gRNA cassette per esempio, sei PCRs sono necessarie, che cinque con DNA stringhe come modelli e uno con la spina dorsale di vettore come il modello. Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo di 98 ° C per 1 min 30 s; 38 cicli di 98 ° C per 10 s, 59 ° C (per ponteggio gRNA) / 68 ° C (per ciclo di SAM) per 10 s, 72 ° C per 30 s (per inserti) / 1 min 30 s (per vettori); 1 ciclo di 72 ° C per 10 min. Rimuovere 5,5 µ l dalla reazione di PCR, Aggiungi tintura di caricamento e analizzare i frammenti amplificati su gel di agarosio 1%. Carico una scaletta di DNA appropriata per dimensionamento (100 bp DNA ladder/1 kb DNA ladder) ed eseguire il gel in un funzionamento appropriato gel buffer (ad es., TLE buffer) a 120 V per 30 min. Mentre il gel è in esecuzione, aggiungere 5 µ l di buffer fornito con l’enzima di restrizione e 0,5 µ l DpnI (10 unità) per la reazione di PCR µ 44,5 l rimanente e incubare per 30 min a 1 h a 37 ° C. Eseguire la purificazione del DNA usando i branelli magnetici. Aggiungere 1,8 perline magnetico µ l per 1 µ l di prodotto PCR e Miscelare pipettando su e giù. Incubare per 2 min a temperatura ambiente (TA). Perline e frammenti di DNA separate dal liquido residuo con un magnete. Lavare perle due volte con etanolo al 70% di risciacquo il pellet senza risospendere completamente. Rimuovere tutti i etanolo con una pipetta e lasciare asciugare il pellet aria. Dissolva la pallina in 15-20 µ l H2O pipettando su e giù e separare le perle dal liquido utilizzando un magnete. Trasferire il surnatante chiaro ad un nuovo tubo.Nota: In alternativa, kit di pulizia basata su colonne di reazione può essere utilizzato. Determinare le concentrazioni di DNA usando uno spettrofotometro come descritto altrove29. 4. Gibson Assembly reazione e trasformazione batterica Nota: I seguenti passaggi sono adattati da Gibson et al. 30. Preparare una fatta in casa Gibson reazione mescolare o utilizzare un kit di clonazione commerciale di Gibson. Combinare 3 mL di 1 M Tris (Tris (idrossimetil) amminometano)-HCl a pH 7.5, 300 µ l di 1 M MgCl, 60 µ l di 100 millimetri di dGTP (deossiguanosina trifosfato), 60 µ l di 100 millimetri di dATP (deossiadenosina trifosfato), 60 µ l di 100 millimetri di dTTP (deossitimidina trifosfato) e 60 µ l di 100 mM dCTP ( deossicitidina trifosfato), 300 µ l di 1 M DTT (dithiothreitol), 1,5 g di PEG-8000 (polietilene glicole), 300 µ l di 100 mM NAD (nicotinamide adenina dinucleotide) e aggiungere H2O per ottenere 6 mL di buffer di reazione isotermica × 5.Nota: Aliquotati tampone può essere conservato a-20 ° C per almeno 12 mesi. Per il master di montaggio Gibson mescolare, unire 320 µ l di tampone di reazione isotermica x 5 con 697 µ l di H2O e aggiungere 3 µ l di 10 esonucleasi T5 U / µ l, 20 µ l di 2 U / µ l DNA polimerasi e 160 µ l di 40 U / µ l Taq DNA ligasi.Nota: Questo mix può essere aliquotati e conservati a-20 ° C per almeno 12 mesi. Utilizzare 7,5 µ l di mix master Assemblea con 2,5 µ l di insert e vettoriale. Per una reazione di x STAgR 2 utilizzare un vettore molare per inserire il rapporto di 1:1 ma non più di 0,2 pmol di DNA in totale. Per più di 2 cassette di espressione gRNA, utilizzare un vettore per inserire il rapporto di 1:3, ma non superare una quantità di DNA totale di 0,5 pmol.Nota: Tutte le cassette di espressione amplificata gRNA devono essere utilizzate in quantità equimolari. Includere un controllo di plasmide con l’identica quantità di vettore ma senza inserti di controllo per non digerito template vettoriale (e/o auto-legatura). Incubare i campioni a 50 ° C per 45-60 min. esempi di Store su ghiaccio o a-20 ° C per la successiva trasformazione.Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Direttamente trasformare metà del mix in batteri chimicamente competenti. Scongelare chimicamente competenti TOP10 Escherichia coli batteri sul ghiaccio. Aggiungere 5 µ l della miscela Gibson per 50 µ l di batteri competenti. Mescolare delicatamente, spostando il fondo della provetta. Incubare in ghiaccio per 30 min. Eseguire una scossa di calore inserendo il tubo in bagnomaria a 42 ° C o un blocco di calore per 45 s. Rimontare i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 250 µ l di terreno SOC per i batteri e far loro recuperare a 37 ° C in un incubatore d’agitazione per 30 – 45 min. Dopo il recupero, piastra i batteri trasformati su piastre di agar brodo (LB) di 1,5% Lisogenesi contenente ampicillina (100 µ g / mL) e incubare per una notte a 37 ° C. 5. selezione dei cloni STAgR di PCR della colonia batterica Preparare almeno due insiemi di 200 provette di reazione di PCR di µ l (tra 3 e 24) per ogni costrutto, che sono etichettati in modo identico. Riempire un set con 100 µ l LB contenente 100 µ g / ampicillina mL. Utilizzare una pipetta sterile per grattare il materiale biologico di una colonia batterica e si è diffuso nella parte inferiore del tubo di reazione di PCR 100 µ l vuoto. Trasferire immediatamente la punta per il secondo tubo di reazione corrispondente contenente il mezzo LB. Agitare delicatamente la punta intorno affinché alcuni dei batteri vengono trasferiti ai media LB e incubare a 37 ° C per un uso successivo. Impostare un mix master di PCR (10 µ l per reazione). Per 10 reazioni, unire 10 µ l di tampone di Taq , 2 µ l 10 mM dNTPs, 0,5 µ l di primer (100 µM), 0,5 µ l di Taq polimerasi e aggiungere un volume di 100 µ l di H2O. Utilizzare i seguenti primer: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG. Aggiungere 10 µ l di master mix PCR di provette di reazione PCR senza il supporto LB. Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo di 94 ° C per 5 min, 38 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 2 min; 1 ciclo di 72 ° C per 10 min.Nota: Tempo di allungamento (passo di 72 ° C) dovrebbe essere aumentato con il numero di cassette espressione gRNA. Calcolare la dimensione teorica di inserti utilizzando la tabella 2 e utilizzare 1 min a 1 kb a 72 ° C. Aggiungere il colorante di caricamento e analizzare i frammenti amplificati su gel di agarosio all’1%. Caricare una scaletta di DNA appropriata per dimensionamento (1kb DNA Ladder) ed eseguire il gel appropriato in tampone (ad es., TLE Buffer) di corsa a 120 V per 30 min. Calcolare la dimensione teorica del amplicon con l’aiuto della tabella 2 sommando le dimensioni individuali dei promotori usati, gRNA scaffolds e numero delle sequenze di N20. Dai risultati della Colonia PCR, identificare i cloni batterici basati sulla taglia corretta e se sono propensi a vettori corrette del porto. Inoculare una cultura LB pernottamento 2,5 mL (con 100 ampicillina µ g/mL) con la corrispondente cultura 100 µ l, impostata in precedenza. Incubare a 37 ° C per 12 ore. Estrarre il DNA plasmidico utilizzando un kit mini commerciale plasmide e istruzioni31 del produttore. Sequenza i plasmidi utilizzando i seguenti primer: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) e StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) mediante sequenziamento Sanger.