Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

1. strateji klonlama STAgR tasarımını Kaç gRNA kaset bir ifade vektör ve hangi sırada dahil olacağına karar verin. Hangi rehberleri ve gRNA belirlemek iskele her gRNAs için kullanılmalıdır. GRNAs herhangi bir çevrimiçi araç (Örneğin, www.benchling.com) kullanarak tasarlayın. 2. astar ile çıkıntılar klonlama STAgR tasarımını Not: Son gRNA anlamda protospacer dizisi ve ilk gRNA antisens sırasıyla eklenir vektör omurga (Şekil 1) amplifikasyon için kullanılan PCR astar. Kalan dizileri böylece anlam ve istenen sırada antianlamlı gRNAs ekleme dizeleri, güçlendirilmiş. İlk dize parça ilk gRNA bir çıkıntı olarak N20 serisi içeren bir ileri astar ve ikinci gRNA N20 serisi (geriye doğru tamamlayıcı) olarak bir çıkıntı ile ters bir astar ile güçlendirilmiş. Aşağıdaki parça buna göre oluşturulur. N20 gRNA dizileri ileri amplifikasyon astar (Tablo 1) sarkma gibi STAgR DNA dizesi için ekleyin. Anlamda gRNA dizileri 5′ (için geleneksel bir iskele) ileri astar “scf-FP” veya “sam-FP” (için bir MS2 içeren iskele) ekleyin. FP astar ilgili STAgR dize (Şekil 1) iskele/MS2 parçası tavlamak. Geriye doğru tamamlayıcı N20 gRNA sıra ters astar serileri ekleyin. RP astar belirli rehberleri ve kullanılan Dizgiler (hU6-RP, RP mU6, 7sK-RP, H1-RP) bağlı olarak seçin. 3. nesil STAgR parçaları klonlama PCR Gibson derleme için bireysel klonlama parçaları üretmek için yüksek sadakat (HF) arabellek, 10 mM dNTPs 1 µL, 0,25 µL çıkıntı-astar (100 µM), 10 10 µL kadar ayarlayarak gerçekleştirmek şablonu (dize veya vektör), 0,5 µL DNA HF polimeraz ng , Dimetil sülfoksit (DMSO) 1,5 µL ve son hacmi 50 µL yapmak için H2O ekleyin.Not: SAM Scaffold seçilirse plazmid “STAgR_Neo” bir şablon olarak omurga PCR için son gRNA için gRNA iskele dahil kullanmak için “STAgR_SAM” kullanın. STAgR plazmid ile altı gRNA kasetler için örneğin, altı PCR DNA ile beş şablonları ve şablon olarak vektör omurga ile dizeleri gereklidir. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 98 ° C 1 döngüsü için 1 dk 30 sn; 38 98 ° C devredir 10 s, (için gRNA iskele) 59 ° C / 68 ° C (SAM döngü) 10 s, 30 72 ° C s (için ekler) / 1 dk 30 s (için vektörel çizimler); 1 çevriminde 10 dk 72 ° c. 5.5 µL PCR reaksiyon gelen kaldırmak, yükleme boya eklemek ve % 1’özel jel güçlendirilmiş parçaları analiz. Yük (100 bp DNA merdiven/1 kb DNA merdiven) işlemi ve Çalıştır uygun jel çalışan bir jel için uygun bir DNA merdiven arabellek (Örneğin, TLE arabellek) 120 V 30 dk için. Jel çalışırken, Restriksiyon enzimi ve 0.5 µL ile sağlanan arabellek 5 µL eklemek Dpnkalan 44,5 µL PCR reaksiyon için ben (10 adet) ve 1 h 37 ° C’de 30 dk için kuluçkaya DNA arıtma manyetik boncuklar kullanarak gerçekleştirin. 1 µL PCR ürününün başına 1.8 µL manyetik boncuklar ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. (RT) Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya. Boncuk ve DNA parçalarının bir mıknatıs ile kalan sıvı ayırmak. Boncuk % 70 etanol ile iki kez tamamen resuspending olmadan Pelet durulama ile yıkayın. Bir pipet ile tüm etanol çıkarın ve kuru Pelet hava girsin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından 15-20 µL H2O Pelet dağıtılması ve boncuk sıvıdan bir mıknatıs kullanarak ayırın. Açık süpernatant için yeni bir tüp aktarın.Not: Alternatif olarak, sütunlara göre tepki temizlik kitleri kullanılabilir. Başka bir yerde29açıklandığı gibi bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonu belirlemek. 4. Gibson derleme tepki ve bakteriyel dönüştürme Not: Aşağıdaki adımları Gibson ve ark. adapte olmuşlardır 30. Reaksiyon karıştırın ya da ticari bir Gibson klonlama setini kullanın ev yapımı bir Gibson hazırlayın. 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) birleştirmek-HCl pH 7.5, 1 M MgCl, 100 mM dGTP (deoxyguanosine trifosfat) 60 µL, 100 mM dATP (deoxyadenosine trifosfat) 60 µL, 100 mM dTTP (deoxythymidine trifosfat) 60 µL, 100 mM dCTP (60 µL 300 µL deoxycytidine trifosfat), 300 µL 1 m DTT (dithiothreitol), PEG-8000 (Polietilen glikol), 300 µL (Nikotinamid adenin dinükleotit) 100 mm NAD 1.5 g ve 6 mL 5 × izotermal tepki arabelleği elde etmek için H2O ekleyin.Not: Bölünmemeli arabellek-20 ° C’de en az 12 ay süreyle saklanabilir. Gibson derleme master için mix, 5 x izotermal tepki arabelleği 320 µL H2O 697 µL ile birleştirmek ve 10 U/µL T5 eksonükleaz 3 µL, 2 U/µL DNA polimeraz 20 µL ve 40 U/µL Taq DNA ligaz 160 µL ekleyin.Not: Bu karışımı bölünmemeli ve saklı-20 ° C’de en az 12 ay için olabilir. Derleme ana Mix 7.5 µL Ekle ve vektör 2.5 µL ile kullanın. 2 x STAgR reaksiyon için molar vektör oranı 1:1 ama fazla 0.2 pmol DNA’ın toplam eklemek için kullanın. 2’den fazla gRNA ifade kaset, bir vektör oranı 1:3 eklemek için kullanın ama 0.5 pmol toplam DNA miktarı fazla olamaz.Not: Tüm güçlendirilmiş gRNA ifade kaset ekimolar miktarlarda kullanılması gerekir. Plazmid denetim vektör ama sindirilmemiş şablon vektör (ve/veya kendi kendine ligasyonu) için denetim yok ekler aynı miktarda içerir. Örnekleri buz üzerinde 45-60 dk. mağaza örnekleri için 50 ° C’de veya sonraki dönüşüm-20 ° C’de kuluçkaya.Not: Protokol burada duraklatılmış. Doğrudan karışımı yarısını kimyasal olarak yetkili bakteri dönüşümü. Kimyasal olarak yetkili TOP10 E. coli bakteri buz çözme. Gibson karışımı 5 µL yetkili bakterilerin 50 µL ekleyin. Tüp alt flicking tarafından karışımı yavaşça. 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya. Isı şok tüpü 42 ° C su banyosu ya da 45 için bir ısı blok yerleştirerek gerçekleştirmek s. Tüpler geri buza koy. SOC orta 250 µL bakteri için eklemek ve onları titreyen bir kuluçka 30-45 dk 37 ° C’de kurtarmak. Sonra kurtarma, dönüştürülmüş bakteri % 1.5 lysogeny suyu (LB) ağar kaplamalar ampisilin içeren üzerine plaka (100 µg / mL) ve gecede 37 ° C’de kuluçkaya 5. STAgR klonlar bakteriyel koloni PCR tarafından seçilmesi 200 µL PCR reaksiyon tüpler (3 ila 24) en az iki takım da aynı şekilde etiketlenir her yapı için hazır olun. Bir set ile 100 µL LB orta 100 µg içeren dolgu / mL ampisilin. Bir bakteriyel koloninin biyolojik malzeme kapalı scratch için steril pipet ucu kullanın ve boş 100 µL PCR reaksiyon tüp alt kısmında yayıldı. Hemen ucunu LB orta içeren ikinci karşılık gelen tepki tüp aktarın. İpucu çevresinde bazı bakteri LB medyaya transfer edilir ve daha sonra kullanmak için 37 ° C’de kuluçkaya emin olmak için yavaşça girdap. PCR ana mix (reaksiyon başına 10 µL) ayarlayın. 10, birleştirmek 10 µL Taq tampon, 2 µL 10 mM dNTPs, astar (100 µM), Taq polimeraz 0.5 µL 0.5 µL ve H2O 100 µL bir birime ekleyin. Aşağıdaki astar kullanın: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG. Etiketli PCR reaksiyon tüpler LB ortamı olmadan 10 µL PCR ana karışımı ekleyin. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 1 döngüsü 38 94 ° C devredir 30 94 ° C 5 min için s, 30 55 ° C s, 72 ° C için 2 dk; 1 çevriminde 10 dk 72 ° c.Not: Uzama süresi (72 ° C adım) gRNA ifade kaset sayısı artırılmalıdır. Tablo 2 kullanarak ekler teorik boyutunu hesaplamak ve 1 kb başına 1 dk 72 ° C’de kullanın Yükleme boya ekleyin ve % 1’özel jel güçlendirilmiş parçaları analiz. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yük (1kb DNA merdiven) ve 120 V 30 dk için arabellek (Örneğin, TLE arabellek) çalıştıran içinde uygun jel çalıştırın. Amplicon teorik boyutu Tablo 2 yardımı ile kullanılan rehberleri, gRNA iskele ve N20 sıraların sayısını bireysel boyutları kadar ekleyerek hesaplar. PCR koloninin sonuçlarından, doğru Grup boyutu ve bunların doğru vektörel çizimler liman olasılığı olup göre bakteriyel klonlar tanımlayın. 2,5 mL gecede LB Kültür (ile 100 µg/mL ampisilin) daha önceden ayarladığı karşılık gelen 100 µL kültür ile aşılamak. 12 h için 37 ° C’de kuluçkaya. Plazmid DNA bir ticari plazmid mini kit ve üreticisinin yönergeleri31kullanarak ayıklayın. Aşağıdaki primerler kullanılarak plazmid dizi: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) ve StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) tarafından Sanger sıralama.