Aquí, presentamos cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR), un método para multiplexar fácilmente gRNA vectores para CRISPR/Cas9 enfoques. Fantasía STAgR hace gRNA multiplexación simple, eficiente y adaptable.
El sistema CRISPR/Cas9 bacteriano ha aumentado considerablemente las opciones metodológicas para que los científicos de la vida. Debido a su utilización, ingeniería genética y genómica hizo aplicable a una amplia gama de sistemas. Por otra parte, muchos transcripcional y epigenómica ingeniería enfoques ahora son generalmente factibles por primera vez. Una de las razones de la amplia aplicabilidad de CRISPR radica en su naturaleza bipartita. Pequeño gRNAs determinar los objetivos de la genómicos del complejo, variantes de la proteína Cas9 y las consecuencias moleculares locales. Sin embargo, muchos enfoques CRISPR dependen la entrega simultánea de múltiples gRNAs en células individuales. Aquí, presentamos un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR), un método que permite la generación sencilla, rápida y eficiente de gRNA multiplexado vectores de expresión la clonación de un solo paso. Fantasía STAgR es rentable, ya que (en este protocolo) las secuencias de objetivos individuales son introducidas por cartillas de voladizo corto mientras que las plantillas de ADN largas de los cassettes de expresión gRNA pueden reutilizarse varias veces. Por otra parte, fantasía STAgR permite incorporación solo paso de un gran número de gRNAs, así como combinaciones de gRNA diferentes variantes, vectores y promotores.
Cadena montaje gRNA (fantasía STAgR) la clonación es un método eficiente la generación de vectores de expresión que contiene la expresión de gRNA varias cintas en una clonación solo paso. El protocolo de fantasía STAgR no depende de materiales o conocimientos especializados y ofrece múltiples opciones de personalización.
La proteína bacteriana de CRISPR Cas9 tiene una capacidad única. Es capaz de encontrar y atar selectivamente sólo las secuencias de ADN codificadas en crRNAs natural o gRNAs ingeniería1. Su utilización como una herramienta molecular ha permitido un gran número de enfoques que eran imposible, inviable o limitada solamente a ciertos modelos celulares hasta hace poco. Se trata de mutaciones específicas del gen2, ingeniería del genoma3, epigenoma edición4,5,6, la activación transcripcional y7,8el silenciamiento del gen. Por lo que sabemos que CRISPR es universalmente utilizable, como informes de su aplicación existe para una amplia gama de sitios de destino, especies y tipos celulares. Sin embargo, muchas aplicaciones de CRISPR dependen directa o indirectamente la entrega de múltiples gRNAs incluyendo una serie de manipulaciones genómicas (translocaciones9,10, media11 y alteraciones genómicas a gran escala 12 , 13), ingeniería de genoma (uso de Cas9 nickases14), generación de alelos condicional11,15 o16de la serie de mutaciones y trazar estrategias17. Por otra parte, para otros enfoques (transcripcional ingeniería18, epigenoma ingeniería19,20) varios sitios apuntados no son estrictamente obligatorio, sin embargo alcanzan su máximo efecto a menudo solamente bajo esta condición.
Se han descrito varios métodos útiles para generar vectores de gRNA que contiene más de un gRNA expresión cassette21,22,23,24,25,26, 27. Aquí, presentamos un protocolo de fantasía STAgR, cadena montaje gRNA clonación, que es excepcional en su combinación de simplicidad y velocidad (sólo una noche a la mañana paso clonación es necesario), bajo costo (como plantillas de la DNA pueden ser reutilizadas varias veces), personalización (para gRNA diferentes sistemas y promotores) y efectividad (permite la generación de vectores que contienen un número elevado de gRNA casetes)28.
Fantasía STAgR puede en principio ser utilizado para generar vectores de expresión con pocos (1-2 gRNAs), varios (3 – 5 gRNAs) y algunos de la mayor cantidad de casetes de expresión registrados hasta ahora (6-8 gRNAs)28. Del mismo modo, fantasía STAgR es aplicable para cualquier secuencia de gRNA, columna vertebral o promotor. Puesto que sin embargo, la fantasía STAgR se basa principalmente en reacciones en cadena de polimerasa (PCR) y Asamblea de Gibson, gRNAs con similitudes de secuencia alta deben generarse utilizando un método alternativo.
Aquí presentamos un protocolo detallado para fantasía STAgR permitiendo la generación rápida y sencilla de gRNA plásmidos de expresión de diferentes tamaños. Este protocolo puede ser utilizado para la generación de un solo paso de gRNA plásmidos con casetes de expresión de la gRNA 2 – 8 (con o sin dos ARN MS2 aptámeros) en el vector de expresión de gRNA STAgR_Neo y el uso de humano U6, U6 del ratón, 7sK humano y humana H1 promotores28 ,32,33. Si se desean más de cuatro cintas, se recomienda utilizar al menos dos tipos diferentes de promotor/andamio para aumentar la eficiencia. Otros vectores, promotores y combinaciones promotor así como más de 8 casetes de gRNA podrían ser factibles sin embargo, esto no ha sido probado. Aunque en nuestra experiencia el método funciona de forma fiable y reproducible, hemos determinado los pasos críticos y estrategias de resolución de problemas el resultado esperado no inmediatamente ocurriera. En nuestra experiencia algunos pasos son fundamentales para el éxito de la estrategia: primero y principal, es importante utilizar las correcta relaciones molares de inserciones en la espina dorsal del vector en el paso de montaje de Gibson (3:1). Sin embargo, notamos que para algunos conjuntos de gRNA una relación 1:1 de inserciones a vector es beneficiosa, incluso cuando el número de cassettes de gRNA exceda de dos. En segundo lugar, el período de la reacción de la Asamblea de Gibson debe ser suficientemente largo (por lo menos 45 min recomendado).
Fantasía STAgR puede emplearse con una gran cantidad de modificaciones. Dirigidas a secuencias, gRNA números y andamios, promotores y redes troncales de vector se pueden personalizar y combinar libremente. Sin embargo, cada combinación puede tener requisitos un poco diferentes. En nuestra experiencia, si medio o alto número de cassettes de gRNA (> 4) son deseados pero no obtiene inmediatamente, generalmente la manera más rápida de resolver este problema es cambiar el orden de los cassettes de gRNA individuales en el vector. Del mismo modo, combinar la gRNA diferentes promotores y andamios mejora la eficiencia (y así disminuye el número de PCR de Colonia que se anotó) cuando se clonan muchos casetes de gRNA. Encontramos que clones incorrecta son generados generalmente por la conjunción espontánea de secuencias repetidas durante el montaje de Gibson. Aunque esto puede reducir la eficacia del método, esto también resulta en la generación simultánea de vectores con gRNA funcional subconjuntos28.
Se ha reportado generación de multiplexación gRNA vectores que contienen más de un cassette de expresión gRNA con un número de diversos métodos21,22,23,24,25, 26,27. Mientras que algunos emplean simultánea o secuencial de clonación de gRNA pares22,34, otros dependen de ensambladura de la puerta de oro y varias secuencial clonación pasos25,35. Un enfoque especial ha sido utilizado por Xie et al., empleando endógeno tRNA procesamiento sistema celular para cortar gRNAs varios de un solo progenitor transcripción36. La advangetage de este método es la exigencia de un único promotor; el inconveniente es la necesidad de los fragmentos de DNA recién sintetizadas de cada combinación de gRNA. Cada gRNA multiplexación método tiene ventajas y desventajas; Fantasía STAgR combina simplicidad con la eficacia, alto número de cassettes de gRNA posible con bajo costo.
Fantasía STAgR (y otros sistemas de multiplexación) será fundamental para permitir la interrupción eficiente (y simultánea) de múltiples genes en vivo, como pionero en el pez cebra cerebros28. Otra futura aplicación de gRNA vectores multiplexación es la promesa para la manipulación de programas completos transcripcionales en contraste con la inducción o represión de genes individuales. Probablemente, estos enfoques permitirá transformar las células y órganos en el va a un grado mucho mayor de lo que hoy es posible.
The authors have nothing to disclose.
Los autores quisieran gracias Prof. Dr. Stephan Beck y Prof. Dr. Jovica Ninkovic por sus aportes, ayuda y apoyo en el desarrollo del fantasía STAgR método. Tobias Klötzer, Anna Köferle y Valentin Baumann para comentarios. El trabajo ha sido apoyado por DFG (STR, 1385, 1-1).
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |