Um protocolo personalizáveis para String Assembly gRNA clonagem (STAgR)

1. projeto de STAgR estratégia de clonagem Decida sobre quantos gRNA cassettes será incluídos no vetor de uma expressão e em que ordem. Determinar quais promotores e gRNA andaimes devem ser usados para cada um do gRNAs. Desenha o gRNAs usando qualquer ferramenta on-line (por exemplo, www.benchling.com). 2. projeto de STAgR clonagem Primers com saliências Nota: A sequência de protospacer sentido de gRNA o passado e o antisentido de gRNA o primeiro respectivamente são adicionados para os primers PCR utilizados para a amplificação do backbone vector (Figura 1). As sequências restantes são amplificadas de cadeias de caracteres, assim anexar o sentido e antisentido gRNAs na ordem desejada. A primeira sequência de peça é amplificada com um primer frente contendo o primeiro gRNA N20 sequência como uma saliência e um primer reverso com a gRNA segunda sequência N20 (complemento reversa) como uma saliência. Todas as peças seguintes são geradas em conformidade. Adicione N20 gRNA sequências para os primers de amplificação para a frente para sequência de ADN STAgR como saliências (tabela 1). Adicione sequências de gRNA sentido 5′ para a frente da primeira demão “scf-FP” (para um andaime convencional) ou “sam-FP” (para um andaime contendo MS2). As primeiras demão FP anneal para a cadafalso/MS2 parte da cadeia de caracteres respectivos STAgR (Figura 1). Adicione o complemento reverso N20 gRNA sequência para as sequências de inversa da primeira demão. Escolha as primeiras demão RP dependendo dos promotores específicos e cadeias de caracteres usadas (RP-hU6, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP). 3. geração de STAgR clonagem de fragmentos Para gerar os fragmentos individuais de clonagem para montagem de Gibson, executar PCRs pela criação de 10 µ l de tampão de alta fidelidade (HF), 1 µ l de dNTPs 10 mM, 0,25 µ l de saliência-primer (100 µM), 10 ng de polymerase de ADN modelo (cadeia de caracteres ou vetor), 0,5 µ l HF , 1,5 µ l de Dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionar o H2O para fazer um volume final de 50 µ l.Nota: Use o plasmídeo “STAgR_Neo” como um modelo para a espinha dorsal do PCR para incorporar o andaime gRNA para a gRNA ontem, se o SAM Scaffold é escolhido, use “STAgR_SAM”. Para um plasmídeo STAgR com gRNA seis fitas por exemplo, seis PCRs são necessárias, que cinco com DNA de sequências de caracteres como modelos e um com a espinha dorsal de vetor como o modelo. Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo de 98 ° C por 1 min 30 s; 38 ciclos de 98 ° C por 10 s, 59 ° C (para andaime gRNA) / 68 ° C (para loop de SAM) por 10 s, 72 ° C por 30 s (para inserções) / 1 min 30 s (para vetores); 1 ciclo de 72 ° C por 10 min. Remover a 5,5 µ l da reação de PCR, Adicionar corante de carregamento e analisar os fragmentos amplificados em um gel de agarose 1%. Uma escada de DNA apropriada para dimensionamento (100 bp DNA escada/1 kb DNA ladder) e executar o gel em um gel de adequada execução de carga Reserva (por exemplo, buffer TLE) em 120 V por 30 min. Enquanto o gel está em execução, adicione 5 µ l de buffer fornecido com a enzima de restrição e 0,5 µ l DpnI (10 unidades) para a reação de PCR restante 44,5 µ l e incube por 30 min a 1 h a 37 ° C. Realize a purificação de DNA usando esferas magnéticas. Adicionar 1,8 grânulos de magnético µ l por 1 µ l de produto do PCR e misture pipetando para cima e para baixo. Incube durante 2 min à temperatura ambiente (RT). Contas separadas e fragmentos de DNA de líquido residual com um ímã. Lave grânulos duas vezes com etanol 70% enxaguando a pelota sem resuspending completamente. Remover todos os etanol com uma pipeta e seque ao ar da pelota. Dissolva a pelota em 15 – 20 µ l H2O pipetando para cima e para baixo e separar os grânulos do líquido usando um ímã. Transferi o sobrenadante claro para um tubo novo.Nota: Alternativamente, kits de limpeza reação baseada na coluna podem ser usados. Determine as concentrações de DNA usando um spectrophotometer conforme descrito em outro lugar,29. 4. Gibson Assembly reação e transformação bacteriana Nota: As etapas a seguir são adaptadas de Gibson et al . 30. Prepare uma Gibson caseiro reação misturar ou usar um kit de clonagem comercial Gibson. Combine 3 mL de 1 M Tris (Tris (hidroximetil) aminometano)-HCl pH 7,5, 300 µ l de 1 M de MgCl 60 µ l de 100 mM dGTP (Desoxiguanosina trifosfato), 60 µ l de 100 mM dATP (Desoxiadenosina trifosfato), 60 µ l de 100 mM dTTP (cromatografia trifosfato), 60 µ l de 100 mM dCTP ( Desoxicitidina trifosfato), 300 µ l de 1 M DTT (ditiotreitol), 1,5 g de 8000-PEG (polietileno glicol), 300 µ l de 100mm NAD (dinucleótido de nicotinamida e adenina) e adicionar o H2O para obter 6 mL de tampão de reação isotérmica × 5.Nota: Aliquotada tampão pode ser armazenado a-20 ° C durante pelo menos 12 meses. Para o mestre de montagem Gibson misturar, combinar 320 µ l de tampão de reação isotérmica x 5 com 697 µ l de H2O e adicionar 3 µ l de 10 do exonuclease T5 U / µ l, 20 µ l de 2 U / µ l de DNA polimerase e 160 µ l de 40 ligase do ADN de Taq U / µ l.Nota: Esta mistura pode ser aliquotadas e armazenado a-20 ° C durante pelo menos 12 meses. Use 7,5 µ l do mix de mestre de montagem com 2,5 µ l de inserção e vetor. Para uma reação de x STAgR 2 usa um vetor de molar para inserir a proporção de 1:1, mas não mais de 0,2 pmol de DNA total. Por mais de 2 fitas de expressão gRNA, usar um vetor para inserir a proporção de 1:3 mas não exceda uma quantidade de DNA total de 0,5 pmol.Nota: Todas as fitas de expressão amplificada gRNA devem ser usadas em montantes equimolar. Inclua um controle de shRNA com o montante idêntico do vetor, mas sem inserções de controle para o modelo não digerida vector (e/ou ligadura self). Incube as amostras a 50 ° C para amostras de 45 a 60 min. loja no gelo ou a-20 ° C para posterior transformação.Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Diretamente transforme metade da mistura em bactérias quimicamente competentes. Descongele quimicamente competentes TOP10 Escherichia coli bactérias no gelo. Adicione 5 µ l do mix Gibson para 50 µ l de bactérias competentes. Misture suavemente por agredir o fundo do tubo. Incube no gelo por 30 min. Executar um choque térmico, colocando o tubo no banho maria a 42 ° C ou um bloco de calor por 45 s. Calce os tubos de gelo. Adicionar 250 µ l de meio SOC para as bactérias e deixá-los a recuperar a 37 ° C numa incubadora de agitação por 30-45 min. Após a recuperação, placa as bactérias transformadas em placas de ágar de caldo (LB) 1,5% lisogenia contendo ampicilina (100 µ g / mL) e incubar durante uma noite a 37 ° C. 5. seleção de Clones de STAgR por PCR de colônia bacteriana Prepare pelo menos dois conjuntos de 200 µ l reação da polimerase (entre 3 e 24) para cada construção, que são rotulados de forma idêntica. Preencher um conjunto com meio LB 100 µ l contendo 100 µ g / ampicilina mL. Use uma ponta de pipeta estéril para raspar o material biológico de uma colônia bacteriana e espalhá-lo no fundo do tubo de reação de PCR de 100 µ l vazio. Transferi imediatamente a ponta para o segundo tubo de reação correspondente, contendo o meio LB. A ponta ao redor agitar suavemente o frasco para assegurar algumas bactérias são transferidas para a mídia LB e incubam a 37 ° C para uso posterior. Prepare uma mistura de mestre de PCR (10 µ l por reação). Para 10 reações, combinar 10 µ l de buffer de Taq , 2 µ l 10mm dNTPs, 0,5 µ l de primer (100 µM), 0,5 µ l de Taq polimerase e adicionar um volume de 100 µ l de H2O. Use os seguintes primers: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG. Adicione 10 µ l da mistura mestre PCR para os tubos de reação de PCR rotulados sem a mídia LB. Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo de 94 ° C por 5 min, 38 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 1 ciclo de 72 ° C por 10 min.Nota: O tempo de alongamento (etapa de 72 ° C) deve ser aumentado com o número de fitas de expressão gRNA. Calcular tamanho teórico de inserções usando a tabela 2 e usar 1 min por 1 kb a 72 ° C. Adicionar corante de carregamento e analisar os fragmentos amplificados em um gel de agarose a 1%. Carregar uma escada de DNA apropriada para dimensionamento (1kb DNA Ladder) e executar o gel apropriado em reserva (por exemplo, o Buffer) em execução em 120 V por 30 min. Calcule o tamanho teórico do amplicon com a ajuda da tabela 2 por somando os tamanhos individuais de promotores usados, gRNA andaimes e número de sequências de N20. Partir dos resultados da colônia do PCR, identifica os clones bacterianos baseados o tamanho correto da banda e se eles são propensos a abrigar vetores corretos. Inocule a cultura correspondente de 100 µ l, configurada anteriormente, uma cultura LB 2,5 mL durante a noite (com 100 ampicilina µ g/mL). Incube a 37 ° C, durante 12 h. Extrair o DNA do plasmídeo usando um kit de mini plasmídeo comercial e de instruções do fabricante31. Sequenciar os plasmideos usando os seguintes primers: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) e StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) por sequenciamento Sanger.