כאן, אנו מציגים מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה בקלות מגה-פלקס gRNA וקטורים עבור גישות CRISPR/Cas9. STAgR הופך gRNA ריבוב פשוטה ויעילה, הניתנים להתאמה אישית.
מערכת CRISPR/Cas9 חיידקי הגדילה מתודולוגי אפשרויות עבור המדענים החיים. בשל ניצול שלה, הנדסה גנטית, גנומית הפך החלים על מגוון רחב של מערכות. יתר על כן, רבים תעתיק גישות הנדסה epigenomic נמצאים כעת בדרך כלל ריאלי בפעם הראשונה. אחת הסיבות תחולתה הרחבה של CRISPR טמון טבעה דו-צדדי. GRNAs קטן לקבוע המטרות גנומית של המתחם, גרסאות של החלבון Cas9, ההשלכות מולקולרית מקומיים. עם זאת, גישות CRISPR רבות תלויות מסירת gRNAs מרובים בו זמנית לתוך תאים בודדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR), שיטה המאפשרת ביטוי וקטורים בשיבוט יחיד הדור פשוטה, מהירה ויעילה של gRNA מרובבת צעד. STAgR היא חסכונית, מאז (ב פרוטוקול זה) רצפי מיקוד בודדים מוצגים על ידי הסככה קצר תחל בעוד תבניות DNA ארוך של הקלטות ביטוי gRNA ניתן להשתמש מחדש מספר פעמים. יתר על כן, STAgR מאפשר צעד בודד התאגדות של מספר גדול של gRNAs, כמו גם שילובים של גרסאות שונות gRNA, וקטורים, היזמים.
מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR) היא שיטה המאפשרת דור לילה יעיל של וקטורים ביטוי המכיל ביטוי gRNA מספר קלטות בשיבוט יחיד אחד צעד. פרוטוקול STAgR אינה תלויה מומחה מומחיות או חומרים, ומציע אפשרויות מרובות עבור התאמה אישית.
החלבון CRISPR חיידקי Cas9 יש יכולת ייחודית. הוא מסוגל למצוא ואיגוד באופן סלקטיבי רק האלה רצפי DNA מקודד crRNAs טבעי או מהונדסים gRNAs1. ניצול שלו ככלי מולקולרית אפשרה מספר רב של גישות בלתי אפשרי, ישים או מוגבלת מסוימים דגמי הסלולר עד לאחרונה. אלה כוללים גנים יישוב מוטציות2, הנדסה גנום3, epigenome עריכה4,5,6, הפעלת גנים ברמת השעתוק ו ג’ין להשתיק7,8. ככל שאנחנו יודעים ש-CRISPR היא אוניברסלית הניתנות לפריסה, כמו דוחות של היישום שלה קיימות עבור מגוון רחב של אתרי היעד, סוגי תאים מינים. עם זאת, יישומים CRISPR רבים תלויים באופן ישיר או עקיף המסירה של gRNAs מרובים כולל סדרה של מניפולציות גנומית (translocations9,10, בינוני11 ו שינויים גנומית בקנה מידה גדול 12 , 13), אסטרטגיות17בהנדסת הגנום (שימוש Cas9 nickases14), דור של אללים מותנה11,15 או מוטציות טורי16והמעקב. יתר על כן, עבור גישות אחרות (תעתיק הנדסה18, epigenome19,הנדסה20) מספר אתרי מיקוד אינם חובה אך ורק, אולם שיגיעו האפקט המקסימלי שלהם לעתים קרובות רק מתחת לזה התנאי.
תוארו מספר שיטות שימושי ליצירת וקטורים gRNA המכילה אחד או יותר gRNA ביטוי קלטת21,22,23,24,25,26, 27. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור STAgR, gRNA הרכבה מחרוזת שיבוט, אשר יוצא מן הכלל שלה שילוב של פשטות, מהירות (לילה אחד בלבד שלב שכפול נדרש), עלות נמוכה (כמו תבניות DNA חוזר מספר פעמים), ההתאמה האישית (עבור מערכות gRNA שונים של היזמים) והיעילות (זה מאפשר את הדור של וקטורים המכיל מספר גבוה של קלטות gRNA)28.
STAgR באופן עקרוני ניתן להשתמש כדי ליצור ביטוי וקטורים עם מספר (1-2 gRNAs), מספר (3-5 gRNAs) וחלק המספר הגבוה ביותר של הביטוי קלטות שדווחו עד כה (6-8 gRNAs)28. באופן דומה, STAgR ישימה לכל רצף gRNA, עמוד השדרה או יזם. מאז. אולם, STAgR מתבסס בעיקר על תגובות שרשרת של פולימראז (PCR) והרכבה גיבסון, צריך ניתן להפיק gRNAs עם דמיון גבוה רצף שיטה חלופית.
כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור STAgR המאפשר הדור מהירה ופשוטה של פלסמידים ביטוי gRNA בגדלים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש בשלב אחד בדור של פלסמידים gRNA עם 2 – 8 קלטות של ביטוי gRNA (עם או בלי aptamers MS2 RNA שני) לתוך הווקטור הביטוי gRNA STAgR_Neo, ואת השימוש האנושי U6, העכבר U6, 7sK האנושי האנושי H1 היזמים28 ,32,33. אם יותר מ-4 קסטות הם הרצויה, מומלץ להשתמש לפחות שני סוגים שונים יזם/לגרדום כדי להגביר את היעילות. וקטורים אחרים, היזמים, יזם שילובים, כמו גם יותר מ- 8 קלטות gRNA יכול להיות ריאלי כמו גם; עם זאת, זה לא נבדק. למרות מניסיוננו שהשיטה עובדת בצורה אמינה, reproducibly, יש לנו נחוש שלבים קריטיים לפתרון בעיות אסטרטגיות מהי התוצאה הצפויה לא מיד להתבצע. מניסיוננו כמה צעדים הם מרכזי להצלחה של הגישה: בראש ובראשונה, חשוב להשתמש את היחס הנכון טוחנת של מוסיף לשדרת וקטור בשלב ההרכבה גיבסון (3:1). עם זאת, הבחנו לערכות gRNA קצת יחס 1:1 של מוסיף וקטוריים זה מועיל, גם כאשר מספר קלטות gRNA יעלה על שניים. שנית, התקופה של התגובה הרכבה גיבסון צריכה להיות ארוכה דיה (לפחות 45 דקות מומלץ).
STAgR יכול להיות מועסק עם מספר גדול של שינויים. פילוח רצפים, gRNA מספרים, פיגומים, היזמים, עמוד השדרה וקטור ניתן להיות אישית, בשילוב בחופשיות. עם זאת, כל צירוף ייתכן דרישות מעט שונות. מניסיוננו, אם בינונית או גבוהה מספר קלטות gRNA (> 4) רצוי אך לא לקבל באופן מיידי, בדרך כלל היא הדרך המהירה ביותר כדי להתגבר על בעיה זו כדי לשנות את הסדר של הקלטות gRNA בודדים בוקטור. באופן דומה, שילוב של gRNA שונים ובעלי פיגומים משפר את יעילות (ו ובכך מורידה את המספר הנדרש של מותני המושבה חייב להיות הבקיע) כאשר קלטות gRNA רבים הם משובטים. מצאנו כי שיבוטים שגוי בדרך כלל נוצרים על-ידי מפגש ספונטני של רצפים חוזרים ונשנים במהלך ההרכבה גיבסון. אמנם זה יכול להפחית את היעילות של השיטה, גם התוצאה הדור בו זמנית של וקטורים עם קבוצות משנה פונקציונלי gRNA28.
דור של ריבוב וקטורים gRNA המכילה אחד או יותר gRNA ביטוי קלטת דווחה עם מספר רב של שיטות שונות21,22,23,24,25, 26,27. בעוד כמה מעסיקים בו זמנית או רציפים שיבוט של gRNA זוגות22,34, אחרים תלויים הרכבה שער הזהב ואת מספר רציפים שיבוט שלבים25,35. גישה מיוחדת שימש. שייה et al., על ידי העסקת אנדוגני הסלולר tRNA עיבוד המערכת לחתוך מספר gRNAs מתוך תעתיק קדמון יחיד36. Advangetage של שיטה זו היא הדרישה של יזם אחד בלבד; החיסרון הוא הצורך שברי DNA מסונתז לאחרונה עבור כל שילוב gRNA. כל gRNA ריבוב שיטה יש יתרונות וחסרונות; STAgR משלב פשטות עם יעילות, מספר גבוה של קלטות gRNA אפשרי עם עלות נמוכה.
STAgR (ומערכות אחרות multiplexing) צפוי להיות אינסטרומנטלי הפעלת הפרעה יעיל (וגם בו זמנית) של מספר גנים ויוו, כמו חלוץ דג זברה המוח28. יישום נוסף בעתיד gRNA ריבוב וקטורים הוא ההבטחה של מניפולציה של תוכניות תעתיק מלא בניגוד אינדוקציה או דיכוי של גנים יחיד. סביר להניח, גישות אלה יאפשרו הפיכת תאים ואיברים -יהיה ברמה גבוהה יותר מאשר אפשרי היום.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה תודה פרופ ‘ ד ר סטפן בק, פרופ ‘ ד ר Jovica נינקוביק לקבל את התשומה שלהם, לעזור ולתמוך בפיתוח השיטה STAgR. טוביאס Klötzer, אנה Köferle, ולנטין באומן להערות מועיל. העבודה היא נתמכה על ידי DFG (STR 1385/1-1).
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |