بروتوكول قابل للتخصيص "الجمعية سلسلة" جرنة الاستنساخ (ستأجر)
Summary
هنا، فإننا نقدم سلسلة الجمعية جرنا الاستنساخ (ستأجر)، أسلوب متعدد ناقلات جرنا بسهولة لنهج كريسبر/Cas9. ستأجر يجعل الإرسال المتعدد جرنة بسيطة وفعالة وقابلة للتخصيص.
Abstract
نظام كريسبر/Cas9 البكتيرية زيادة كبيرة في الخيارات المنهجية لعلماء الحياة. نظراً لاستخدامها، أصبحت الهندسة الوراثية والجينوم تنطبق على مجموعة كبيرة من النظم. وعلاوة على ذلك، العديد من النسخي والنهج الهندسية ابيجينوميك الآن عموما ممكناً للمرة الأولى. يكمن أحد أسباب انطباق واسع كريسبر في طبيعته ثنائي. جرناس الصغيرة تحدد أهدافا الجينوم للمجمع والمتغيرات من البروتين Cas9 والآثار الجزيئية المحلية. ومع ذلك، نهج كريسبر كثيرة تعتمد على إيصال جرناس متعددة متزامنة في الخلايا الفردية. هنا، فإننا نقدم بروتوكولا لتخصيص لجرنا الجمعية سلسلة الاستنساخ (ستأجر)، خطوة أسلوب يسمح توليد بسيطة وسريعة وفعالة لجرنا متعدد ناقلات التعبير في استنساخ واحد. ستأجر فعالة من حيث التكلفة، حيث (في هذا البروتوكول) تسلسل استهداف الفردية التي يتم تقديمها بواسطة كبسولة تفجير عبء قصيرة بينما قوالب الحمض النووي طويلة من أشرطة الكاسيت التعبير جرنة يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. وعلاوة على ذلك، يسمح ستأجر إدراج خطوة واحدة من عدد كبير من جرناس، فضلا عن مجموعات من المتغيرات المختلفة جرنة وناقلات والمروجين.
Introduction
جرنة الجمعية سلسلة الاستنساخ (ستأجر) هو أسلوب تمكين كفاءة توليد بين عشية وضحاها من ناقلات التعبير الذي يحتوي على التعبير جرنة عدة أشرطة الكاسيت في استنساخ واحدة واحدة خطوة. لا تعتمد على الخبرة المتخصصة أو مواد البروتوكول ستأجر ويوفر خيارات متعددة للتخصيص.
البروتين كريسبر البكتيرية Cas9 لديها قدرة فريدة من نوعها. أنها قادرة على إيجاد وربط بشكل انتقائي فقط تسلسل الحمض النووي المشفر في كرناس طبيعيا أو جرناس المهندسة1. وقد مكن الانتفاع بها كأداة جزيئية عددا كبيرا من النهج التي كانت مستحيلة وغير مجد أو يقتصر فقط على بعض النماذج الخلوية حتى وقت قريب. تشمل هذه الطفرات الجينات المستهدفة2، هندسة الجينوم3، ابيجينومي تحرير4،،من56والتنشيط النسخي والجينات إسكات7،8. وبقدر ما نعلم كريسبر الانتشار عالمياً، كتقارير عن تطبيق موجود لمجموعة واسعة من المواقع المستهدفة، وأنواع الخلايا والأنواع. ومع ذلك، تعتمد العديد من كريسبر التطبيقات مباشرة أو غير مباشرة على إيصال جرناس متعددة بما في ذلك سلسلة من التلاعب الجينوم (المولدة9،10، متوسطة11 وتعديلات واسعة النطاق الجينوم 12 , 13)، هندسة الجينوم (استخدام Cas9 نيكاسيس14)، وتوليد الآليلات الشرطي11،15 أو16من الطفرات المسلسل وتتبع استراتيجيات17. وعلاوة على ذلك، للنهج الأخرى (النسخي الهندسية18،19،الهندسية epigenome20) متعددة تستهدف مواقع ليست إلزامية صارما، إلا تصل إلى أثرها الأقصى غالباً إلا في إطار هذا الشرط.
وقد وصفت عدة طرق مفيدة لتوليد نواقل جرنة التي تحتوي على أكثر من جرنة التعبير كاسيت21،،من2223،24،25،26، 27. نقدم هنا، بروتوكولا ستأجر، جرنة الجمعية سلسلة الاستنساخ، وهي معلقة في مزيج البساطة والسرعة (واحد فقط بين عشية وضحاها المسبق الخطوة الاستنساخ)، منخفضة التكلفة (كما يمكن إعادة استخدام قوالب الحمض النووي عدة مرات)، (لمن التفصيل نظم جرنة مختلفة والمروجين) وفعالية (أنها تسمح توليد المتجهات التي تحتوي على عدد كبير من شرائط جرنة)28.
ستأجر يمكن من حيث المبدأ أن تولد ناقلات التعبير بقليل (جرناس 1 – 2)، عدة (جرناس 3 – 5)، وبعض من أكبر عدد من أشرطة الكاسيت التعبير أفادت حتى الآن (جرناس 6 – 8)28. وبالمثل، ستأجر قابل للتطبيق لأي تسلسل جرنة أو العمود الفقري أو مروج. منذ بيد ستأجر يستند أساسا بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) والجمعية جيبسون، يجب إنشاء جرناس مع أوجه التشابه في تسلسل عالية باستخدام أسلوب بديل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بروتوكول مفصل ستأجر السماح بتوليد سريعة وبسيطة لجرنا التعبير والبلازميدات ذات أحجام مختلفة. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لتوليد خطوة واحدة من البلازميدات جرنة مع 2-8 جرنة التعبير من أشرطة الكاسيت (مع أو بدون الابتامرات رنا MS2 اثنين) إلى ناقل التعبير جرنة STAgR_Neo، واستخدام U6 البشرية والماوس U6، 7sK البشرية والبشرية H1 المروجين28 ،،من3233. إذا كان المرغوب فيها أكثر من أربعة أشرطة الكاسيت، يوصي باستخدام أنواع مختلفة المروج/سقالة اثنين على الأقل لزيادة الكفاءة. ناقلات أخرى والمروجين وتركيبات المروج، فضلا عن أكثر من 8 جرنة الأشرطة قد يكون ممكناً كذلك؛ ومع ذلك، وهذا لم يتم اختباره. على الرغم من أن تجربتنا يعمل الطريقة موثوق بها وتكاثر، لقد حددنا خطوات حاسمة واستكشاف الاستراتيجيات ينبغي أن النتيجة المتوقعة ليس على الفور تحدث. في تجربتنا، بعض الخطوات محورية لنجاح النهج: أولاً وقبل كل شيء، من المهم أن استخدام نسب المولى الصحيحة من إدراج لناقلات العمود الفقري في خطوة الجمعية جيبسون (3:1). ومع ذلك، فقد لاحظنا أن بعض مجموعات جرنة بنسبة 1:1 من إدراج لناقلات مفيد، حتى عندما يتجاوز عدد كاسيت جرنة اثنين. وثانيا، ينبغي أن تكون فترة رد فعل الجمعية جيبسون طويلة بما فيه الكفاية (على الأقل 45 دقيقة الموصى بها).
ويمكن توظيف ستأجر مع عدد كبير من التعديلات. استهداف متواليات، جرنة الأرقام والسقالات والمروجين وناقلات العمود الفقري يمكن تخصيصها وبحرية جنبا إلى جنب. ومع ذلك، قد يكون كل تركيبة متطلبات مختلفة قليلاً. في تجربتنا، إذا كانت متوسطة أو عالية أرقام الأشرطة جرنا (> 4) المطلوب ولكن لم يحصل فورا، عادة أسرع طريقة للتغلب على هذه المشكلة تغيير ترتيب الأشرطة الفردية جرنا في مكافحة ناقلات. وبالمثل، الجمع بين المروجين جرنة مختلفة والسقالات ويحسن كفاءة (ومما يخفض العدد المطلوب من مستعمرة تقارير إتمام المشروعات التي تحتوي على سجل) عندما يتم استنساخ العديد من أشرطة الكاسيت جرنة. ووجدنا أن الحيوانات المستنسخة غير صحيحة يتم إنشاؤها عادة بالاقتران العفوي من تسلسلات مكررة أثناء الجمعية جيبسون. على الرغم من أن هذا يمكن أن تقلل من كفاءة الأسلوب، هذه النتائج أيضا في توليد المتزامن للناقلة مع المجموعات الوظيفية جرنة28.
تم عن جيل من الإرسال المتعدد ناقلات جرنة التي تحتوي على أكثر من جرنة التعبير كاسيت مع عدد من أساليب مختلفة21،،من2223،24،25، ،من 2627. بينما بعض توظيف متزامنة أو متتابعة استنساخ جرنة أزواج22،34، الآخرين تعتمد على الجمعية البوابة الذهبية وعديدة متتابعة الاستنساخ الخطوات25،35. وقد استخدمت شيه et al.، نهجاً خاصا باستخدام نظام المعالجة الحمض الريبي النووي النقال الخلوية الذاتية قطع جرناس عدة من نص السلف واحد36. أدفانجيتاجي هذا الأسلوب هو شرط المروج واحد فقط؛ العيب هو الحاجة إلى شظايا المركبة حديثا من الحمض النووي لكل تركيبة جرنة. وقد جرنة كل الإرسال المتعدد الأسلوب مزايا وعيوب؛ ستأجر يجمع بين البساطة بكفاءة وعدد كبير من أشرطة الكاسيت جرنة ممكن بتكلفة منخفضة.
ستأجر (وغيرها من النظم المتنوعة) سيكون على الأرجح مفيداً في تمكين اختلال الكفاءة (والمتزامنة) متعددة الجينات في فيفو، كما كانت رائدة في الزرد أدمغة28. آخر التطبيق المستقبلي لناقلات المتنوعة جرنة هو الوعد للتلاعب بالبرامج النسخي كاملة خلافا للاستقراء أو قمع الجينات واحدة. المحتمل، سوف تسمح هذه النهج سيتم تحويل الخلايا والأجهزة في درجة أعلى بكثير مما ممكن في اليوم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن أشكر الأستاذ الدكتور ستيفان بيك والأستاذ الدكتور جوفيكا نينكوفيك على مدخلاتها، والمساعدة والدعم في تطوير أسلوب ستأجر. توبياس Klötzer وأنا Köferle باومان فالنتين التعليقات المفيدة. العمل الذي أيده DFG (STR 1385/1-1).
Materials
| Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
| dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
| dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
| Agarose | VWR | 443666A | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
| Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
| DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
| PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
| NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
| T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
| Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
| Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
| DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
| Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
| EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
| MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
| Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
| Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
| NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
| Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |
References
- Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 16, 247 (2015).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
- Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering. Genome Med. 7 (1), 59 (2015).
- Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology. BMC Genomics. 17 (1), 739 (2016).
- Jiang, J., et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 6, 21918 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Wang, L., et al. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. Scientific Reports. 5, 17517 (2015).
- Zhang, L., et al. Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 10 (3), 0120396 (2015).
- Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Bultmann, S., Stricker, S. H. Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics. Open Biology. 8 (3), (2018).
- Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators. FEBS Journal. , (2016).
- Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
- Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Wrighton, K. H., et al. Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes. Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).
- Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970 (2016).
- Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), 147 (2014).
- Cress, B. F., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS ONE. 13 (4), 0196015 (2018).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (1982).
- Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917 (2016).
- Koferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. Journal of Visualized Experiments. (130), e56264 (2017).
- Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4, 5400 (2014).
- Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).
