Un protocole personnalisable pour chaîne Assemblée gRNA clonage (STAgR)

1. conception de STAgR stratégie de clonage Décider sur combien gRNA cassettes seront inclus dans le vecteur d’une expression et dans quel ordre. Déterminer les promoteurs et les gRNA échafaudages doivent servir à chacun du gRNAs. Concevoir le gRNAs en utilisant n’importe quel outil en ligne (p. ex., www.benchling.com). 2. conception de STAgR clonage des amorces avec porte-à-faux Remarque : La séquence de protospacer sens de la dernière gRNA et l’anti-sens de la première gRNA sont respectivement ajoutés pour les amorces PCR utilisées pour l’amplification de l’épine dorsale du vecteur (Figure 1). Les séquences restantes sont amplifiées des cordes, attachant ainsi le sens et antisens gRNAs dans l’ordre souhaité. La première chaîne morceau est amplifié avec un primer avant contenant la première gRNA N20 séquence sous un surplomb et un apprêt inverse avec la deuxième gRNA N20 séquence (complément inverse) sous un surplomb. Toutes les pièces suivantes sont générées en conséquence. Ajouter des séquences gRNA N20 pour les amorces avant amplification pour chaîne d’ADN de STAgR que surplombe (tableau 1). Ajouter sens gRNA des séquences 5′ à l’apprêt avant « EFC-FP » (pour les échafauds classiques) ou « sam-FP » (pour les échafauds contenant MS2). Des amorces FP recuisent à la partie de l’échafaudage/MS2 de la chaîne de STAgR respectif (Figure 1). Ajouter le complément inverse N20 gRNA séquence aux séquences d’amorce de marche arrière. Le choix des amorces RP selon les promoteurs spécifiques et les cordes utilisées (RP-hU6, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP). 3. génération de clonage de Fragments de STAgR Pour générer les fragments individuels de clonage pour Assemblée de Gibson, effectuer PCRs en mettant en place 10 µL de tampon de haute fidélité (HF), 1 µL de 10 mM dNTPs, 0,25 µL de surplomb-primer (100 µM), 10 ng de la polymérase ADN modèle (chaîne ou vecteur), 0,5 µL HF , 1,5 µL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et ajouter H2O pour faire un volume final de 50 µL.Remarque : Utilisez le plasmide « STAgR_Neo » comme modèle pour la colonne vertébrale PCR d’incorporer l’échafaud gRNA à la dernière gRNA, si l’on choisit le Scaffold SAM, utilisez « STAgR_SAM ». Pour un plasmide STAgR avec gRNA six cassettes par exemple, six RFT est nécessaires, que cinq avec l’ADN des chaînes comme modèles et l’autre avec l’épine dorsale du vecteur comme modèle. Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle de 98 ° C pendant 1 min 30 s ; 38 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 59 ° C (pour échafaudage gRNA) / 68 ° C (pour la boucle de SAM) pendant 10 s, 72 ° C pendant 30 s (pour les insertions) / 1 min 30 s (des vecteurs) ; 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min. Enlever 5.5 µL de la réaction PCR, ajoutez le colorant de chargement et d’analyser les fragments amplifiés sur un gel d’agarose à 1 %. Charge une échelle d’ADN appropriée pour dimensionnement (100 bp échelle/1 kb DNA échelle d’ADN) et exécuter le gel dans une gestion appropriée de gel tampon (par exemple, buffer TLE) à 120 V pendant 30 min. Lorsque le gel est en marche, ajouter 5 µL de la mémoire tampon fournie avec l’enzyme de restriction et de 0,5 µL DpnI (10 unités) de la réaction de PCR 44,5 µL restante et laisser incuber 30 min à 1 h à 37 ° C. Effectuer la purification de l’ADN à l’aide de billes magnétiques. Ajouter 1,8 billes magnétiques µL par 1 µL du produit PCR et mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber pendant 2 min à température ambiante (RT). Séparer les perles et les fragments d’ADN de liquide résiduel avec un aimant. Laver les perles deux fois avec l’éthanol à 70 % en rinçant le culot sans resuspendant complètement. Retirer tout l’éthanol avec une pipette et laissez le pellet air sec. Dissoudre le culot dans 15 à 20 µL H2O de pipetage de haut en bas et séparer les perles du liquide à l’aide d’un aimant. Transférer le liquide clair surnageant dans un nouveau tube.Remarque : Par ailleurs, kits de nettoyage basée sur les colonnes de réaction peuvent être utilisés. Déterminer les concentrations d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre comme décrit ailleurs29. 4. Gibson Assemblée réaction et Transformation bactérienne Remarque : Les étapes suivantes sont adaptées de Gibson et al. 30. Préparer une maison Gibson réaction mélanger ou utiliser un kit clonage commercial de Gibson. Mélanger 3 mL de 1 M Tris (Tris (hydroxyméthyl) aminométhane)-HCl pH 7.5, 300 µL de 60 µL de (dCTP) 100 mM, 60 µL de dATP 100 mM (adénosine triphosphate), 1 M MgCl, 60 µL de dTTP 100 mM (désoxythymidine triphosphate), 60 µL de 100 mM dGTP (désoxyguanosine triphosphate) désoxycytidine triphosphate), 300 µL de 1 M DTT (dithiothréitol), 1,5 g de PEG-8000 (polyéthylène glycol), 300 µL de 100 mM NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) et ajouter H2O pour obtenir 6 mL de tampon de réaction isotherme × 5.Remarque : Aliquoté tampon peut être stocké à-20 ° C pendant au moins 12 mois. Pour le maître de l’Assemblée de Gibson mélanger, combiner 320 µL de tampon de réaction isotherme 5 x 697 µL d’H2O et ajouter 3 µL de 10 U/µL T5 exonucléase, 20 µL de 2 U/µL ADN polymérase et 160 µL de 40 U/µL Taq DNA ligase.Remarque : Ce mélange peut être aliquotés et congelés à-20 ° C pendant au moins 12 mois. Utilisez 7,5 µL du mélange maître Assemblée avec 2,5 µL d’insertion et de vecteur. Pour une réaction x STAgR 2 utilisez un vecteur molaire pour insérer le ratio de 1:1 mais pas plus de 0,2 pmol d’ADN au total. Pour plus de 2 cassettes d’expression gRNA, utilise un vecteur d’insérer le rapport de 1:3, mais ne dépassent pas un montant total de l’ADN de 0,5 pmol.Remarque : Toutes les cassettes d’expression amplifié gRNA doivent être utilisés en quantités équimoléculaires. Inclure un contrôle plasmidique avec la somme identique de vecteur mais aucune insertions au contrôle pour non digérés template vecteur (ou individu-ligature). Incuber les échantillons à 50 ° C pendant 45 à 60 min. des échantillons de magasin sur la glace ou à-20 ° C pour transformation ultérieure.Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Directement la moitié du mélange de transformer les bactéries compétentes chimiquement. Décongeler les bactéries TOP10 Escherichia coli chimiquement compétents sur la glace. Ajouter 5 µL du mélange Gibson à 50 µL de bactéries compétentes. Mélanger doucement en effleurant le fond du tube. Incuber sur glace pendant 30 min. Effectuer un choc thermique en plaçant le tube dans un bain d’eau de 42 ° C ou un bloc chauffant pour 45 s. Remettez les tubes sur glace. Ajouter 250 µL de milieu SOC pour les bactéries et les laisser récupérer à 37 ° C dans un incubateur à agitation pendant 30 à 45 min. Après la restauration, de la plaque les bactéries transformées sur 1,5 % lysogénie bouillon (LB) boîtes de gélose contenant l’ampicilline (100 µg / mL) et incuber une nuit à 37 ° C. 5. sélection des Clones de STAgR par PCR sur colonie bactérienne Préparer au moins deux séries de 200 tubes de réaction PCR µL (entre 3 et 24) pour chaque construction, qui sont étiquetés de manière identique. Remplir un ensemble de 100 µL de milieu LB contenant 100µg / ampicilline mL. Utiliser un embout de la pipette stérile à gratter de la matière biologique d’une colonie bactérienne et l’étaler au fond du tube de réaction de PCR 100 µL vide. Transférer immédiatement la pointe dans le deuxième tube de réaction correspondante contenant le milieu LB. Agiter doucement la pointe autour d’assurer certaines des bactéries sont transférés aux médias LB et incuber à 37 ° C pour une utilisation ultérieure. Mettre en place un mélange maître PCR (10 µL par réaction). 10 réactions, combinez 10 µL de tampon Taq , 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL d’apprêt (100 µM), 0,5 µL de la Taq polymérase et ajouter 100 µL de H2O. Utiliser les amorces suivantes : StAgR_seq_fwd2 : ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev : TTACGGTTCCTGGCCTTTTG. Ajouter 10 µL du mélange maître PCR dans les tubes de réaction PCR marqués sans les médias LB. Incuber les réactions sur un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle de 94 ° C pendant 5 min, 38 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 2 min ; 1 cycle de 72 ° C pendant 10 min.NOTE : Temps d’élongation (72 ° C étape) devrait être augmenté avec le nombre de cassettes d’expression gRNA. Calculer la taille théorique d’insertions à l’aide du tableau 2 et utilisez 1 min par 1 kb à 72 ° C. Ajouter le colorant de chargement et d’analyser les fragments amplifiés sur un gel d’agarose à 1 %. Charger une échelle d’ADN appropriée pour le dimensionnement (1Ko échelle d’ADN) et exécutez le gel approprié en exécutant tampon (par exemple, Buffer TLE) à 120 V pendant 30 min. Calculez la taille théorique de l’amplicon avec l’aide du tableau 2 en additionnant les montants individuels des promoteurs usagés, gRNA échafaudages et nombre de séquences de la N20. Les résultats de la PCR sur colonie, identifier les clones bactériens basées sur la taille de la bande de fréquences correcte et s’ils sont susceptibles de port corrects vecteurs. Ensemencer une 2,5 mL nuit LB (avec 100 ampicilline µg/mL) avec la culture correspondante de 100 µL, mises en place plus tôt. Incuber à 37 ° C pendant 12 h. Extraire l’ADN de plasmide utilisant un kit de mini plasmide commerciale et d’instructions du fabricant31. Séquencer les plasmides en utilisant les amorces suivantes : StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) et StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) par séquençage Sanger.