Eine anpassbare Protokoll für String Montage gRNA Klonen (STAgR)

1. Aufbau der STAgR Klonen Strategie Entscheiden Sie, auf wie viele gRNA Kassetten in einem Expressionsvektor und in welcher Reihenfolge enthalten sein werden. Feststellen, welche Promotoren und gRNA Gerüste für jede der gRNAs verwendet werden soll. Entwerfen Sie die gRNAs, indem mit einem beliebigen Online-Tool (z. B. www.benchling.com). 2. Gestaltung der STAgR Klonen Primer mit Überhängen Hinweis: Die Sinne Protospacer Reihenfolge der letzten gRNA und Antisense des ersten gRNA bzw. werden hinzugefügt, die PCR-Primer zur Verstärkung des Vektor-Backbones (Abbildung 1). Die verbleibenden Sequenzen werden aus den Saiten, damit anbringen der Sense und antisense gRNAs in der gewünschten Reihenfolge verstärkt. Die erste Zeichenfolge Stück wird mit einer vorwärts Grundierung, enthält die erste gRNA N20 Sequenz als Überhang und eine rückwärts-Primer mit der zweiten gRNA N20 Sequenz (umgekehrte Ergänzung) als Überhang verstärkt. Die folgenden Stücke sind entsprechend generiert. Fügen Sie N20 gRNA Sequenzen hinzu, die nach vorne Verstärkung Zündkapseln für STAgR DNA-Zeichenfolge als Überhänge (Tabelle 1). Der forward Primer “Scf-FP” (für eine konventionelle Gerüst) oder “Sam-FP” (für ein MS2 mit Gerüst) Sinn gRNA Sequenzen 5′ hinzufügen. FP Zündkapseln Tempern, das Gerüst/MS2 Bestandteil der jeweiligen STAgR Zeichenfolge (Abbildung 1). Die rückwärts-Primer-Sequenzen die umgekehrte Ergänzung N20 gRNA Sequenz hinzufügen. Wählen Sie RP Primer je nach spezifischen Promotoren und verwendeten Zeichenfolgen (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP). 3. Generation von STAgR Klonen Fragmente Um die einzelnen Klonen Fragmente für Gibson Assembly zu erstellen, führen Sie PCRs durch die Einrichtung von 10 µL der High Fidelity (HF) Puffer, 1 µL 10 mM dNTPs, 0,25 µL Überhang-Grundierung (100 µM), 10 ng der DNA-Vorlage (String oder Vektor), 0,5 µL HF Polymerase , 1,5 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und H2O zu einem Endvolumen von 50 µL hinzufügen.Hinweis: Verwenden Sie das Plasmid “STAgR_Neo” als Vorlage für den PCR-Backbone, um das gRNA Gerüst, um die letzten gRNA zu integrieren, wenn SAM Scaffold gewählt wird, verwenden Sie “STAgR_SAM”. Für ein STAgR Plasmid mit sechs gRNA Kassetten sind beispielsweise sechs PCRs notwendig, fünf mit DNA Stränge als Vorlagen und einer mit dem Vektor-Backbone als Vorlage. Inkubieren Sie Reaktionen auf einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus von 98 ° C für 1 min 30 s; 38 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 59 ° C (für gRNA Gerüst) / 68 ° C (für SAM Schleife) für 10 s, 72 ° C für 30 s (für Einsätze) / 1 min 30 s (für Vektoren); 1 Zyklus von 72 ° C für 10 Minuten. Der PCR-Reaktion entnehmen Sie 5,5 µL, fügen Sie laden Farbstoff hinzu und analysieren Sie die amplifizierten Fragmente auf einem 1 % Agarose-Gel. Last eine entsprechende DNA-Leiter für Dimensionierung (100 bp DNA-Leiter/1 kb DNA-Leiter) und führen Sie das Gel in einen entsprechenden Gel läuft Puffer (z.B. TLE Puffer) bei 120 V für 30 Minuten. Während das Gel ausgeführt wird, fügen Sie 5 µL des Puffers zur Verfügung gestellt mit dem Restriktionsenzym und 0,5 µL DpnI (10 Stück), um die verbleibenden 44,5 µL-PCR-Reaktion und 30 min bis 1 h bei 37 ° c inkubieren Durchführen Sie DNA-Reinigung mit magnetischen Beads. 1,8 µL magnetische Beads pro 1 µL des PCR-Produktes und Mischen von Pipettieren rauf und runter. 2 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Perlen und DNA-Fragmente von Restflüssigkeit mit einem Magneten zu trennen. Waschen Sie Perlen zweimal mit 70 % Ethanol durch Spülen der Pellets ohne resuspending komplett. Entfernen Sie alle Ethanol mit einer Pipette und lassen Sie die Pellet der Luft trocknen. Lösen Sie das Pellet in 15 – 20 µL H2O durch Pipettieren rauf und runter und trennen Sie die Perlen aus der Flüssigkeit zu, indem mit Hilfe eines Magneten. Übertragen Sie den klare Überstand auf einen neuen Schlauch.Hinweis: Alternativ können spaltenbasierten Reaktion Aufräum Kits verwendet werden. DNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer wie an anderer Stelle29beschrieben zu bestimmen. (4) Gibson Assembly Reaktion und bakterielle Transformation Hinweis: Die folgenden Schritte sind von Gibson Et al. 30. Bereiten Sie eine hausgemachte Gibson Reaktion mischen oder eine kommerzielle Gibson cloning Kit verwenden. Kombinieren Sie 3 mL 1 M Tris (Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane)-HCl bei pH 7,5, 300 µL 1 M MgCl, 60 µL 100 mM dCTP (60 µL 100 mM dGTP (Deoxyguanosine Triphosphat), 60 µL 100 mM dATP (Deoxyadenosine Triphosphat), 60 µL 100 mM dTTP (Deoxythymidine Triphosphat) Deoxycytidine Triphosphat), 300 µL 1 m DTT (Dithiothreitol), PEG-8000 (Polyethylenglykol), 300 µL 100 mm NAD (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide) 1,5 g und H2O 6 mL 5 × isothermen Reaktion Puffer erhalten hinzufügen.Hinweis: RegelmÄÑig Puffer kann bei-20 ° C für mindestens 12 Monate gespeichert werden. Mischen Sie für den Gibson-Montage-Meister, kombinieren Sie 320 µL 5 X isothermen Reaktion Puffer mit 697 µL H2O und 3 µL 10 U/µL T5 Exonuclease, 20 µL 2 U/µL DNA Polymerase und 160 µL 40 U/µL Taq DNA Ligase.Hinweis: Diese Mischung kann regelmÄÑig und gespeicherte bei-20 ° C für mindestens 12 Monate sein. Verwenden Sie 7.5 µL des Montage-master-Mix mit 2,5 µL einfügen und Vektor. Verwenden Sie für 2 X STAgR Reaktion Molaren Vektor zum Verhältnis von 1:1, aber nicht mehr als 0,2 Pmol DNA insgesamt einfügen. Verwenden Sie für mehr als 2 gRNA Expressionskassetten einen Vektor zum Verhältnis von 1:3 einfügen aber überschreiten Sie einen Gesamtbetrag von DNA von 0,5 Pmol nicht.Hinweis: Alle verstärkten gRNA Expressionskassetten sollten äquimolaren Mengen verwendet werden. Gehören Sie ein Plasmid-Steuerelement mit der identischen Menge an Vektor aber keine Einsätze zu steuern für unverdaute Vorlage Vektor (und/oder selbständigen Ligatur). Inkubieren Sie Proben bei 50 ° C für 45 bis 60 min. Store Proben auf Eis oder bei-20 ° C für die anschließende Transformation.Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Verwandeln Sie direkt die Hälfte der Mischung in chemisch kompetente Bakterien. Tauen Sie chemisch kompetente TOP10 E. Coli -Bakterien auf dem Eis. 50 µL kompetente Bakterien 5 µL der Gibson-Mischung hinzufügen. Mischen Sie durch Streichen der Boden des Röhrchens vorsichtig. Inkubation für 30 min auf Eis. Ein Hitzeschock durchführen, indem man den Schlauch in einem 42 ° C Wasserbad oder einem Heizblock für 45 s. Die Rohre wieder auf Eis gelegt. Die Bakterien 250 µL SOC-Medium hinzu und lassen Sie sie bei 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 30 – 45 Minuten zu erholen. Nach seiner Genesung Platte die transformierten Bakterien auf 1,5 % Lysogeny Brühe (LB) Agarplatten mit Ampicillin (100 µg / mL) und über Nacht bei 37 ° c inkubieren 5. Auswahl STAgR Klone von bakteriellen Kolonie PCR Bereiten Sie mindestens zwei Sätze von 200 µL PCR Reaktionsgefäße (zwischen 3 und 24) für jedes Konstrukt, das sind identisch mit der Bezeichnung. Füllen Sie einen Satz mit 100 µL LB-Medium mit 100 µg / mL Ampicillin. Verwenden Sie eine sterilen Pipettenspitze, Rubbel das biologische Material von einer bakteriellen Kolonie und am unteren Rand 100 µL PCR Reaktion Leerrohr zu verbreiten. Sofort übertragen Sie die Spitze auf das zweite entsprechende Reaktionsgefäß mit LB-Medium. Schwenken Sie die Spitze um sanft, damit einige der Bakterien in den LB Medien übertragen und Inkubation bei 37 ° C für die spätere Verwendung. Richten Sie ein PCR-master-Mix (10 µL pro Reaktion). Kombinieren Sie für 10 Reaktionen 10 µL Taq Puffer, 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL des Primers (100 µM), 0.5 µL Taq Polymerase und H2O auf ein Volumen von 100 µL. Verwenden Sie die folgenden Primer: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG. Die beschrifteten PCR Reaktionsgefäße ohne LB Medien 10 µL des PCR-master-Mix hinzufügen. Inkubieren Sie Reaktionen auf einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus von 94 ° C für 5 min, 38 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 2 min; 1 Zyklus von 72 ° C für 10 Minuten.Hinweis: Dehnung Zeit (72 ° C Schritt) sollte mit der Anzahl der gRNA Expressionskassetten erhöht werden. Berechnen Sie theoretische Größe der Einsätze mit Tabelle 2 und verwenden Sie 1 min pro 1 kb bei 72 ° C. Fügen Sie laden Farbstoff und analysieren Sie die amplifizierten Fragmente auf einem 1 % Agarosegel. Laden Sie eine entsprechende DNA-Leiter für die Dimensionierung (1kb DNA-Leiter) und führen Sie die in entsprechenden Gel Puffer (z.B.TLE Puffer) bei 120 V für 30 min laufen. Berechnen Sie die theoretische Größe der Amplifikate mit Hilfe der Tabelle 2 durch Addition der einzelnen Größen verwendeten Promotoren, gRNA Gerüste und Anzahl der N20 Sequenzen. Identifizieren Sie aus den Ergebnissen der Kolonie PCR die bakterielle Klone basierend auf die richtige Bandgröße und ob sie korrekte Vektoren beherbergen dürften. Impfen Sie eine 2,5 mL über Nacht LB-Kultur (mit 100 µg/mL Ampicillin) mit der entsprechenden 100 µL Kultur, früher eingerichtet. Inkubation bei 37 ° C für 12 h. Plasmid-DNA mit Hilfe einer kommerziellen Plasmid Mini Kit und des Herstellers Anweisungen31zu extrahieren. Sequenz der Plasmide, die unter Verwendung der folgenden Zündkapseln: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) und StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) von Sanger-Sequenzierung.