Een aanpasbare Protocol voor String vergadering gRNA klonen (STAgR)

1. ontwerp van STAgR klonen van strategie Besluiten op hoeveel gRNA cassettes zal worden opgenomen in een expressie vector en in welke volgorde. Bepalen welke initiatiefnemers en gRNA steigers moeten worden gebruikt voor elk van de gRNAs. De gRNAs ontwerpen met behulp van een online hulpmiddel (bijvoorbeeld www.benchling.com). 2. ontwerp van STAgR klonen Primers met overhangen Opmerking: De volgorde van de protospacer zin van het laatste gRNA en de antisense van de eerste gRNA respectievelijk worden toegevoegd aan de PCR inleidingen gebruikt voor versterking van de ruggengraat van de vector (Figuur 1). De resterende sequenties zijn versterkt uit de strijkers, daarmee verbonden de betekenis en antisense gRNAs in de gewenste volgorde. De eerste tekenreeks stuk wordt versterkt met een voorwaartse primer met de eerste gRNA N20 reeks als een luifel en een omgekeerde primer met de tweede gRNA N20 volgorde (omgekeerde aanvulling) als een overstek. Alle van de volgende stukken worden dienovereenkomstig gegenereerd. N20 gRNA sequenties toevoegen aan de versterking van de voorwaartse inleidingen voor STAgR DNA tekenreeks zoals overhangt (tabel 1). Zin gRNA sequenties 5′ aan de voorwaartse primer “scf-FP” (voor een conventionele steiger) of “sam-FP” (voor een MS2 met steiger) toevoegen. Ontharden van de FP inleidingen aan het schavot/MS2 deel van de respectieve STAgR-tekenreeks (Figuur 1). De omgekeerde aanvulling N20 gRNA reeks toevoegen aan het omgekeerde primer sequenties. Kies RP inleidingen afhankelijk van de specifieke initiatiefnemers en tekenreeksen gebruikt (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP). 3. generatie van STAgR klonen van fragmenten Voor het genereren van de individuele klonen fragmenten voor Gibson montage, door PCRs uit te voeren door het opzetten van 10 µL van high-fidelity (HF) buffer, 1 µL van 10 mM dNTPs, 0,25 µL van overhang-primer (100 µM), 10 ng van de sjabloon (tekenreeks of vector), 0,5 µL HF polymerase van DNA , 1.5 µL van dimethylsulfoxide (DMSO) en H2O zodat een eindvolume van 50 µL toe te voegen.Opmerking: De plasmide “STAgR_Neo” als sjabloon gebruiken voor de backbone PCR te nemen de gRNA steiger voor de laatste gRNA, als de SAM Scaffold is gekozen, gebruikt u “STAgR_SAM”. Bijvoorbeeld, voor een plasmide STAgR met zes gRNA cassettes zijn zes PCRs nodig, dat vijf met DNA snaren als sjablonen en één met de ruggengraat van de vector als de sjabloon. Incubeer reacties op een thermocycler met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus van 98 ° C voor 1 min 30 s; 38 cycli van 98 ° C voor 10 s, 59 ° C (voor gRNA steiger) / 68 ° C (voor SAM lus) voor 10 s, 72 ° C gedurende 30 s (voor inserts) / 1 min 30 s (voor vectoren); 1 cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten. 5.5 µL van het PCR-reactie verwijderen, toevoegen van laden kleurstof en analyseren van de versterkte fragmenten op een 1% agarose gel. Belasting een geschikte DNA-ladder voor grootte (100 bp DNA ladder/1 kb DNA ladder) en run de gel in een passende gel actief buffer (b.v., TLE buffer) op 120 V voor 30 min. Terwijl de gel wordt uitgevoerd, voeg 5 µL van de buffer die is voorzien van het beperkingsenzym en 0,5 µL DpnI (10 eenheden) bij de resterende 44,5 µL PCR reactie en incubeer gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 37 ° C. Uitvoeren van DNA zuivering met behulp van magnetische kralen. 1.8 µL magnetische kralen per 1 µL van het PCR-product toevoegen en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT). Kralen en DNA-fragmenten van de resterende vloeistof met een magneet te scheiden. Wassen kralen tweemaal met 70% ethanol door de pellet spoelen zonder resuspending volledig. Verwijder alle ethanol met een pipet en laat de pellet lucht drogen. Los van de pellet in 15-20 µL H2O door omhoog en omlaag pipetteren en scheiden de kralen van de vloeistof met behulp van een magneet. Het supernatans dat duidelijk overbrengen in een nieuwe buis.Opmerking: Als alternatief, kolom gebaseerde reactie schoonmaakoperaties kits kunnen worden gebruikt. DNA concentraties met een spectrofotometer zoals elders beschreven29bepalen. 4. Gibson vergadering reactie en bacteriële transformatie Opmerking: De volgende stappen zijn aangepast van Gibson et al. 30. Een zelfgemaakte Gibson reactie mix of gebruik een commerciële Gibson klonen kit voor te bereiden. Combineren van 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane)-HCl bij pH 7.5, 300 µL van 1 M MgCl met 60 µL van 100 mM dGTP (deoxyguanosine-trifosfaat), 60 µL van 100 mM dATP (deoxyadenosine-trifosfaat), 60 µL van 100 mM dTTP (deoxythymidine-trifosfaat), 60 µL van 100 mM dCTP () deoxycytidine trifosfaat), 300 µL van 1 M DTT (dithiothreitol), 1.5 g van PEG-8000 (polyethyleenglycol), 300 µL van 100 mM NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) en H2O om te verkrijgen van 6 mL 5 × isothermische reactie buffer toe te voegen.Opmerking: Aliquoted buffer kan worden opgeslagen bij-20 ° C gedurende ten minste 12 maanden. Voor de Gibson vergadering meester Meng, 320 µL van 5 x isothermische reactie buffer combineren met 697 µL van H2O en voeg 3 µL van 10 U/µL T5 exonuclease, 20 µL van 2 U/µL DNA-polymerase en 160 µL van 40 U/µL polymerase van DNA ligase.Opmerking: Deze mix kan worden aliquoted en opgeslagen bij-20 ° C gedurende ten minste 12 maanden. 7.5 µL van vergadering master mix gebruiken met 2,5 µL van donormateriaal en vector. Gebruik een molaire vector verhouding van 1:1, maar niet meer dan 0,2 pmol van DNA in totaal invoegen voor een 2 x STAgR reactie. Voor meer dan 2 gRNA expressie cassettes, gebruiken om een vector te voegen verhouding 1:3, maar overschrijd niet een totaal bedrag van het DNA van 0.5 pmol.Opmerking: Alle versterkte gRNA expressie cassettes moeten worden gebruikt in mengsel bedragen. Een plasmide-besturingselement met de identieke hoeveelheid vector maar geen inzetstukken aan besturingselement voor onverteerd sjabloon vector (en/of zelf Afbinding) opnemen. Incubeer monsters bij 50 ° C voor 45 tot 60 min. winkel monsters op ijs of bij-20 ° C voor latere transformatie.Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Direct Transformeer de helft van de mix in chemisch bevoegde bacteriën. Ontdooi chemisch bevoegde TOP10 E. coli bacteriën op ijs. Voeg toe 5 µL van het mengsel van Gibson aan 50 µL van bevoegde bacteriën. Meng zachtjes door flicking de onderkant van de buis. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Uitvoeren van een warmte-schok door het plaatsen van de buis in een waterbad van 42 ° C of een warmte blok voor 45 s. Zet de buizen terug op ijs. Voeg 250 µL van SOC medium voor de bacteriën en laat ze herstellen bij 37 ° C in een schudden incubator voor 30-45 min. Na herstel, plaat de getransformeerde bacteriën op 1,5% lysogenie Bouillon (LB) agar platen met ampicilline (100 µg / mL) en na een nacht bebroeden bij 37 ° C. 5. het selecteren van STAgR klonen door bacteriële PCR van de kolonie Voorbereiden op ten minste twee sets van 200 µL PCR reactie buizen (tussen 3 en 24) elke constructie, die worden aangeduid als identiek. Vul één set met 100 µL LB medium dat 100 µg / mL ampicilline. Gebruik een steriele Pipetteer tip krassen uit het biologisch materiaal van een bacteriële kolonie en verspreid het op de bodem van de lege 100 µL PCR reactiebuis. Onmiddellijk overdracht de tip om de tweede overeenkomstige reactiebuis met het LB-medium. Swirl de tip rond zachtjes om enkele van de bacteriën worden overgedragen aan de LB-media en Incubeer bij 37 ° C voor later gebruik. Instellen van een PCR master mix (10 µL per reactie). Voor 10 reacties, combineer 10 µL Taq buffer, 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL primer (100 µM), 0,5 µL van Taq polymerase en H2O toevoegen aan een volume van 100 µL. Gebruik de volgende inleidingen: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG. Voeg toe 10 µL van het PCR master mix aan de gelabelde PCR reactie buizen zonder de LB-media. Incubeer reacties op een thermocycler met behulp van de volgende voorwaarden: 1 cyclus van 94 ° C gedurende 5 minuten, 38 cycli van 94 ° C voor 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 2 minuten; 1 cyclus van 72 ° C gedurende 10 minuten.Opmerking: Rek tijd (72 ° C-stap) moet worden verhoogd met het aantal gRNA expressie cassettes. Berekenen van theoretische omvang van inzetstukken met behulp van tabel 2 en 1 min per 1 kb gebruiken bij 72 ° C. Voeg laden kleurstof en analyseren van de versterkte fragmenten op een 1% agarose gel. Laden van een geschikte DNA-ladder voor de dimensionering (1kb DNA-Ladder) en stel het in passende gel buffer (bijvoorbeeldTLE Buffer) lopen bij 120 V voor 30 min. De theoretische omvang van de amplicon met behulp van tabel 2 berekend door optelling van de individuele maten van gebruikte initiatiefnemers, gRNA steigers en aantal N20 sequenties. Identificeren van de resultaten van de PCR van de kolonie, de bacteriële klonen gebaseerd op de grootte van de juiste band en of ze kunnen haven juiste vectoren. Inoculeer een 2,5 mL overnachting-LB cultuur (met 100 µg/mL ampicilline) met de overeenkomstige 100 µL cultuur, eerder hebt ingesteld. Incubeer bij 37 ° C gedurende 12 uur. Uittreksel plasmide DNA met behulp van een commerciële plasmide mini kit en31instructies van de fabrikant. Volgnummer van de plasmiden met behulp van de volgende inleidingen: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) en StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) door Sanger Sequencing.