Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e purificação de proteínas que são rotulados com isótopos estáveis e posterior caracterização das interações da proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) e microescala Experimentos de Thermophoresis (MST).
Proteínas filamentosas como vimentina fornecem organização dentro das células, fornecendo um andaime estrutural com sites que ligam proteínas contendo plakin repete. Aqui, um protocolo para a detecção e medição de tais interações é descrito usando o domínio globular plakin de envoplakin e a bobina helicoidal da vimentina. Isto fornece uma base para determinar se uma proteína liga vimentina (ou proteínas filamentosas semelhantes) e medição da afinidade da interação. A proteína globular de interesse é rotulada com 15N e titulada com proteína vimentina em solução. Um espectro de NMR bidimensional é adquirido para detectar interações observando alterações na forma de pico ou mudanças químicas e para elucidar os efeitos das condições de solução, incluindo os níveis de sal, que influenciam a estrutura quaternária vimentina. Se a proteína de interesse vincula o ligante filamentoso, a interação de ligação é quantificada pelo MST usando as proteínas purified. A abordagem é uma maneira simples para determinar se uma proteína de interesse vincula um filamento e avaliar como alterações, tais como mutações ou condições de solução, afetam a interação.
Interações entre proteínas permitem a formação de máquinas moleculares que criam ordem dentro das células. As interações individuais muitas vezes são fracas, mas geralmente contribuem para multivalentes complexos que podem ser dinamicamente regulamentado e cooperativo. Ensaios sensíveis que fornecem resolução atômica e informações quantitativas sobre tais interações complexas são necessários para deduzir os mecanismos e projetar intervenções como droga-como moléculas. Espectroscopia RMN é um método eficiente para a obtenção de tais informações sobre as interações da proteína e também é usada para o rastreio rápido para ligantes, incluindo aqueles que se ligam fracamente1. Os métodos NMR usados podem ser categorizados em aqueles que são proteínas observar ou ligante observar. Este manuscrito usa a primeira abordagem, em que é adquirido um espectro de um isótopo estável-rotulado de proteína que é comparativamente pequena (geralmente sob 20 kDa) e o ligante sem rótulo é titulado. Isto permitir que os resíduos rotulados envolvidos na interação a serem mapeados em casos favoráveis. Uma vez as formas complexas, há mudanças na forma de seus sinais NMR e os ambientes químicos de resíduos de interação que se manifestam como alterações na mudança química. A extensão de tais mudanças se correlaciona com o grau de envolvimento destes grupos na interação. Perturbações de deslocamento químico (CSPs) podem ser medidas comparando uma série de espectros NMR da proteína coletados na ausência e presença de quantidades variáveis do ligante. Para maiores ligantes ou interações complexas, a mudança na forma de pico ou intensidade pode ser medida para deduzir as interações.
O experimento 2D mais comum usado para detectar interações ligante é a 15N-heteronuclear quântica única correlação (HSQC) experimento2. Isso requer que uma proteína uniformemente ser rotulado com 15N, que é normalmente conseguida expressá-los como versões de afinidade-tag em Escherichia coli culturas bacterianas crescidas em 15N-enriquecido de mídia. Vinculação é aparente quando os espectros HSQC coletados durante a titulação são sobrepostos, revelando mudanças de pico para um subconjunto dos resíduos envolvidos na formação da complexa. A interação pode ocorrer no regime de troca rápida, onde os sinais de estado livre e ligante saturada colapsam em uma população média de pico. Como alternativa, no caso de troca lenta entre os Estados, ambos os sinais são observados com integrais que representam suas quantidades relativas. Enquanto NMR lineshape análise pode ser usada para estimar as afinidades de ligação, em alguns casos, métodos tais como o MST também provaram ser convenientes e fornecem validação cruzada das interações genuínas.
O exemplo fornecido é de duas proteínas encontradas dentro desmossomas. Eles mediam as junções entre as superfícies da célula e o citoesqueleto e mediam multivalentes interações entre máquinas de adesão celular e filamentos intermediários para manter a integridade da pele e tecidos do coração e resistindo de forças de cisalhamento. Doenças podem resultar quando desmosomal proteínas tais como desmoplakin ou vimentina estão comprometidas por mutações ou auto-anticorpos, levando a desestabilização das junções célula-célula, e, portanto, suas interações são de importância crítica3. A base estrutural de ligação do ligante por proteínas de desmosomal pode ser caracterizada por espectroscopia de RMN, enquanto as interações podem ser quantificadas pelo MST. Métodos aqui foram usados para caracterizar as interações entre domínios repetição plakin (PRDs) que muitas vezes estão presentes como conjuntos em tandem que oferecem básicos sulcos e vimentina, um filamento intermediário que interage através de uma superfície ácida oferecida pela sua helicoidal pacote4. Estes complexos são formados na membrana da célula onde eles de ancoragem para os filamentos intermediários do citoesqueleto celular para desmossomas que conectam células adjacentes, formando assim uma rede de ligações adesivas que irradia ao longo de um tecido.
O 2D 15experiência NMR N-resolvido é um dos mais amplamente utilizados métodos para mostrar como duas moléculas interagem. É o método mais ricos em informação que permite que os sinais de ambos os parceiros a serem monitorados continuamente ao longo de uma experiência de titulação no estado de solução. Embora normalmente qualitativa no caso de grandes complexos, o método também pode ser usado em casos favoráveis para medir afinidades de ligação onde sinais NMR podem ser rastreados em espectros de alta resolução. Onde as atribuições podem ser feitas convenientemente, como no caso de muitas proteínas sob 20 kDa em tamanho, os sítios de ligação também podem ser mapeados. Ensaios complementares tais como MST fornecem informações quantitativas sobre interações em solução e requerem menos proteína nos Estados sem rótulo. Comparação de mutante de ligação de dados é útil para fornecer controles para garantir que interações evidenciadas pela linha NMR alargamento são genuínas e não artefatos de, por exemplo, alterações de agregação ou viscosidade.
Expressão da proteína
Agilizando o processo de expressão reduz a quantidade de produção de proteína intensivo de mão de obra. Parte deste processo de otimização envolve a identificação de uma tensão adequada de e. coli para a expressão recombinante da proteína. Preferência de tensão depende de elementos, incluindo a natureza do vetor em uso e, mais especificamente, a estabilidade final da proteína recombinante está sendo expresso7. O risco de degradação da proteína heteróloga por endógena Escherichia coli proteases podem ser reduzidos pelo uso de protease deficiente Escherichia coli como a estirpe BL21. Para genes contendo códons raros, uma estirpe como RIPL BL21-CodonPlus (DE3) pode ser preferida. Esta estirpe combina a natureza de protease deficiente da estirpe BL21 com cópias adicionais de endógenas de tRNAs códon rara de leucina, isoleucina, prolina e arginina. Alternativamente, códons raros que podem comprometer a superexpressão podem ser evitadas por encomendar uma construção códon otimizado de uma fonte comercial. Muitas cepas de e. coli estão disponíveis para a expressão do gene recombinante, cada um otimizado para evasão de um problema específico durante a expressão7. No caso deste estudo, a estirpe de padrão protease deficiente BL21(DE3) produzido quantidades adequadas de proteína solúvel para purificação subsequente e análise.
Purificação de proteínas
O protocolo de purificação para uma proteína dada frequentemente é único no sentido de que cada proteína permanece estável e solúvel em diferentes condições como temperatura, concentração de sal ou pH. A eficácia global da purificação por cromatografia de afinidade também é sensível à concentração de eluição espécies como imidazol em várias etapas durante o processo de purificação. Neste trabalho, condições de reserva crítica para IMAC foram pH para o E-PRD e concentração de imidazol para o VimRod. Um pH de 7,5 foi necessário para evitar a precipitação do PRD-E após eluição inicial da coluna IMAC. Para a purificação do IMAC de VimRod, aumentando a concentração de imidazole de 30 a 50 mM durante a etapa de lavagem da coluna foi encontrado para ter uma melhoria substancial na pureza das frações eluição final. Para a etapa de eluição, também aumentando a concentração de imidazole de 250 a 350 mM foi encontrado para melhorar o rendimento da eluição final. Tentativas iniciais para eluir proteína usando imidazol 250mm levaram a eluição incompleta de VimRod como revelado por uma tira de imidazol 1m final da coluna (dados não mostrados). Aumentando a concentração de imidazol para 350 mM para a eluição foi suficiente para recuperar toda a proteína associada à coluna. S pode servir a um propósito duplo porque actua como uma etapa de polimento para purificação de proteínas, enquanto simultaneamente, realizando troca de amortecedor. Troca de amortecedor é um passo crítico para análise posterior ligação desde que ele remove o imidazol usada para eluir a proteína His6-tag. Serve também como uma oportunidade para alterar condições tais como a concentração de sal ou pH, que pode afetar a eficácia de certas técnicas de jusante ou ensaios. Proteína térmico turno (PTS) pode ser usado para identificar buffers ideais para ensaios a jusante, especialmente para aqueles que exigem uma proteína estável para prolongados períodos de tempo em temperatura ambiente8,9.
Análise de ligação
Proteína que é preparada é fundamental para os ensaios de ligação exata, embora congelada proteína também pode ser usada desde que os resultados são comparados. Proteínas filamentosas como vimentina multimerize forma um sal e pH dependentes, e, portanto, a solução condição precisa ser otimizado e oligoméricos estado estimado por um método como SEC10,11, dinâmica de espalhamento de luz 12 ou ultracentrifugação analítica13,14,15. Espectroscopia RMN é adequada para medir as interações ligante de pequenas proteínas em resolução atômica. No entanto, quando uma proteína interage com a molécula maior, segue-se o tombo mais lento, e isso resulta em perda de sinais, que pode confirmar a vinculação, embora isso não necessariamente permitem mapeamento de binding sites, que também exigiria a atribuição pelo menos espinha dorsal ressonâncias. Neste cenário, experiências NMR não permitir a identificação do site da interação. Daí o local dirigido mutagênese é aplicado para identificar os resíduos críticos necessários para a ligação. Tais mutantes, portanto, não apresentam perda de sinal. Neste protocolo, uma forma mutante com uma substituição na posição 1914 retém as intensidades de pico na presença de VimRod e, por conseguinte, confirma o rompimento da interação do E-PRD e VimRod. Atribuição de espinha dorsal e sidechain ressonâncias gostaria de acrescentar valor a esta abordagem, particularmente como a estrutura para o livre E-PRD foi resolvida por cristalografia de raios x4. Futuras aplicações de NMR incluem caracterização de interações complexas entre moléculas maiores e beneficiarão de ultra altos ímãs de campo e o uso de outros grupos observáveis como 13C-etiquetadas e trifluoro metil grupos como repórteres.
MST tem uma série de vantagens para o estudo de interações de ligação16. Os parceiros de ligação são livres em solução e não imobilizado. Análise da qualidade das amostras é incorporado o software com controle de qualidade, relatórios de agregação, adsorção aos capilares ou rotulagem fluorescente insuficiente da molécula alvo. Pequenas quantidades do alvo são normalmente utilizadas, a concentração do alvo etiquetado é geralmente entre 20-50 nM em 10-20 μL volume/reação. Este protocolo utiliza volumes de reação muito pequeno (10 μL) para maximizar a concentração de ligante que pode ser alcançado nas titulações permitindo interações fraca ligação ser caracterizada. Isto necessita de pipetagem precisos e cuidado para evitar a introdução de bolhas enquanto ainda completamente a mistura. Mistura adequada é fundamental para a medição de fluorescência exata, consistente ao longo do conjunto de diluições em série. A quantidade de Tween-20 nas experiências de MST foi reduzida de um padrão de 0,05% a 0,015% para reduzir a tendência para criar bolhas e melhorar a mistura.
O corante vermelho-Tris-NTA fornece uma maneira rápida, fácil e conveniente de fluorescente rotular qualquer proteína que tem a sua marca. A rotulagem é efetivamente completo em apenas 30 minutos e é muito apertado para que nenhum procedimento de remoção do corante é necessário. Sem modificações são feitas para resíduos de aminoácidos na proteína que podem alterar as propriedades de ligação do ligante. Uma ressalva é que apenas a proteína a ser rotulado deve ter uma marca de His6. Isto exigiu a clivagem da marca desde a proteína ligante, E-PRD e a remoção da marca e E-PRD uncleaved com uma segunda etapa de coluna do IMAC. Se possível, a proteína ligante deve ser preparada sem o uso de uma sua marca. Alternativamente, as proteínas podem ser rotuladas covalentemente com um fluoróforo através de amina acoplamento de resíduos de lisina ou tiol acoplamento a resíduos de cisteína. No entanto, deve ter cuidado quando se utilizam esses sistemas desde a ligação covalente de um fluoróforo pode afetar as interações de ligação eletrostática ou polar confiando em resíduos de lisina ou a cisteína. A quantificação de vinculação afinidade entre o VimRod e E-PRD pelo MST foi extraordinariamente sensível à concentração de sal. Este problema foi atenuado pelo dializando inicialmente o alvo e ligante no mesmo lote do buffer de ensaio. Não obstante, saturação da curva de ligação do MST não poderia ser alcançada, ao realizar o ensaio de MST na presença de 150 mM de NaCl devido ao comportamento de complexo de VimRod. Confiáveis e completos de dados obteve-se uma vez que a concentração de NaCl foi reduzida a 10 mM, permitindo o cálculo exacto do KD. Portanto, cuidadosa otimização das condições de solução e comparação com ensaios complementares são recomendados para alcançar resultados robustos. Além disso, o MST pode ser utilizado para quantificar a dependência de sal para uma determinada interação, quantificar Propriedades estequiométricas de interações da proteína, monitor do enrolamento de proteínas e sonda em cinética de enzima17.
The authors have nothing to disclose.
Este projecto foi apoiado pelo RGPIN NSERC-2018-04994, programa de inovação Campus Alberta (RCP-12-002 C) e Alberta prião Research Institute / Alberta inova Bio soluções (201600018), atribuído a Otávio e genoma Canadá e Fundação do Canadá para Subsídios de inovação atribuídos para o centro de inovação de Metabolomics (TMIC) e NANUC.
Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |