מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

1. ביטוי חלבון רקומביננטי ביטוי Envoplakin ההקלטה (E-ההקלטה) Vimentin 99-249 (VimRod) להפוך e. coli BL21(DE3) תאים עם פלסמיד המכיל את הגן הרצוי. מורחים את התאים על פלטות אגר המכיל אמפיצילין µg/mL 100. דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לבחור שמושבה בודדת, לחסן 20 מ ל מרק נהדר (TB) המכיל אמפיצילין µg/mL 100 לבחירה פלסמיד. לגדול התרבות ב 37 ° C עם טלטול (180 סל ד) בן לילה. להעביר את התרבות כולה 20 מ ל 1 ליטר של טרה-בתים המכיל 50 אמפיצילין µg/mL. דגירה התרבות ב 37 ° C עם לרעוד-180 סל ד עד ה OD600 = 0.6-0.8. להפחית את הטמפרטורה עד 18 ° C, זירוז ביטוי חלבונים על-ידי הוספת איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) כדי ריכוז סופי של 1 מ מ. המשך הדגירה ב 18 ° C ברעידות-160 סל”ד. בן לילה, כדי לאפשר ביטוי חלבון. לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו את התרבות ב 8000 g x עבור 15 דקות Decant ולמחוק את תגובת שיקוע. תשטוף התאים שנקטפו מאת resuspending בגדר תא כ 40 מ”ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS: 20 מ מ פוספט מאגר, pH 7.4, 120 מ”מ NaCl). להעביר את resuspension צינור 50 מ. צנטריפוגה שוב ב 8000 g x למשך 15 דקות. Decant ולמחוק את תגובת שיקוע. באופן מיידי להתחיל פרוטוקול טיהור או להקפיא את כדורי תא ב-20 ° C לשימוש עתידי. ביטוי של חלבונים Isotopically שכותרתו להפוך תאים BL21(DE3) e. coli ו להכין 20 מ”ל starter תרבות כמו 1.1.1-1.1.2. להעביר את התרבות כולה 20 מ ל 1 ליטר משחפת מועשר המכיל טריפטון g 4.0 נוספים של 5.0 g NaCl, אמפיצילין µg/mL 100. דגירה התרבות ב 37 ° C עם לרעוד-160 סיבובים לדקה עד ה OD600 = 1.6-1.9. הקציר התרבות 1 ליטר על ידי צנטריפוגה ב 8000 g x עבור 15 דקות Decant ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף בגדר תא על-ידי בעדינות resuspending כ 40 מ”ל ל- PBS, להעביר resuspension את שפופרת 50 מ. צנטריפוגה שוב ב 8000 g x עבור 15 דקות Decant ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא ב- 20 מ של מדיה מינימלי M9 (טבלה 1) להעברת השארית של mL 950 של M9 תקשורתי מזערי המכיל אמפיצילין µg/mL 100. להוסיף 50 מ של מסנן לעקר שילוב התזונתי (טבלאות 2 ו- 3). ואקלום התרבות עד 18 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הוספת IPTG ריכוז סופי של 1 מ מ. דגירה בין לילה ב 18 ° C ברעידות-160 סיבובים לדקה. לקצור את התאים כמו סעיף 1.1.4-1.1.6. 2. מרותק למיטה זיקה מתכת טיהור כרומטוגרפיה (IMAC) של VimRod, E-ההקלטה טיהור של מתויג His6 VimRod Resuspend בגדר תא ב 5 מ ל/g ל- PBS המכיל פרוטאז מעכב קוקטייל חסר EDTA. Homogenize עם קווים 12 ב מהמגן רקמות דאונס כדי לשפר את פירוק תאים בשלב הבא. על קרח, sonicate התליה תא-דופק של s ב/1 s 1 הנחה, משרעת 80% עבור סכום כולל של לפחות 1.5 לחזור את sonication נוספים שני פעמים, מתערבל בעדינות על הקרח בין פועל למניעת התחממות יתר. Centrifuge הדגימה ב 75,000 g x עבור 45 דקות Decant ולסנן את תגובת שיקוע באמצעות מסנן מזרק (0.45 מיקרומטר). Equilibrate מ ל IMAC עמודה בעלת 5 כרכים עמודה (CV) של איגוד מאגר (20 מ”מ HEPES, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 10 מ מ) בספיקה של 1 mL/min משתמש במערכת כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) חלבון מהיר. לטעון את תגובת שיקוע המסונן אל העמודה בספיקה של 0.5 mL/min. לשטוף את העמודה עם מאגר קורות חיים של שטוף 5 (20 מ”מ HEPES, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 50 מ מ) בספיקה של 1 מ”ל לדקה. Elute החלבון עם 3 קורות חיים • תנאי מאגר (20 מ”מ HEPES, pH 7.5, 500 מ מ NaCl, imidazole 350 מ”מ) בספיקה של 0.5 מ ל לדקה לאסוף 1.5 mL שברים. אם הוא זמין, בחר את המצב • תנאי זרימה למעלה כדי להגדיל את הריכוז של חלבון eluted. זיהוי השברים של chromatogram FPLC מכילים חלבון עניין מאת מרחביות-דף ולהשתמש בשיטות הרגילות כדי למדוד את הריכוז של חלבון5. בריכה ותתרכזו השברים • תנאי המכיל כמויות חלבון שימוש בהתקן צנטריפוגלית אולטראפילטרציה (kDa MWCO 3, 5 מ ל) עד 2 מ”ל הגבוהה ביותר. צנטריפוגה-21,000 g x כדי להסיר את כל המשקע ועובר דרך מסנן 0.22 μm. Equilibrate בגודל 120 מ ל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (S) עמודה עם מאגר קורות חיים של S 2 (20 מ”מ HEPES, 150 מ מ NaCl, pH 7.5, 0.5 מ מ TCEP) בספיקה של 1 mL/min משתמש של FPLC. להזריק את חלבון מרוכז מ 2.1.9 אל העמודה, elute עם מאגר קורות חיים של S 1 בספיקה של 0.5 mL/min, איסוף השברים 1 מ”ל. זיהוי שברים המכיל חלבון עניין כמו בעבר. בריכת שברים המכיל כמויות חלבון הגבוה ביותר. ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר או להוסיף גליצרול 20% של החנות ב-80 מעלות צלזיוס ב aliquots קטן. טיהור של E-ההקלטה חלבון עם התגית His6 הוסר בצע את השלבים ב 2.1.1-2.1.8 לטהר מתויג His6 E-ההקלטה חלבון. בריכה שברים שיא ולקבוע את הריכוז של חלבון. להוסיף טבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז (1 מ”ג/מ”ל) ב 2 µL/מ ג חלבון במאגר. לעבור דיאליזה אבובים (6 kDa) ו- dialyze S מאגר בן לילה ב 4 º C. שלב זה מאפשר המחשוף של התג His6 והסרה של imidazole זה יפריע איגוד שרף Ni-נ בשלב הבא. Equilibrate מ של שרף Ni-נ בעמודה המשיכה עם מאגר קורות חיים של S 3. מרוקנים את מאגר עודף מ השרף. יוצקים את E-ההקלטה cleaved מחלבון השרף, תקופת דגירה של שעה על פלטפורמה נדנדה כדי לאפשר את uncleaved מתויג His6 E-ההקלטה והתג cleaved His6 לאגד. פרוטאז אס גם מתויג His6, יהיה לאגד השרף. לאסוף את הזרימה, אשר מכיל את ללא תג E-ההקלטה. לשטוף את השרף עם מאגר קורות חיים של S 2 כדי להבטיח כל E-ההקלטה הוא התאושש. להתרכז E-ההקלטה הזרימה 2 מ ל שימוש בהתקן צנטריפוגלית אולטראפילטרציה (kDa MWCO 3, 5 מ ל). צנטריפוגה ב g 21 000 x להסיר כל המשקע ולעבור דרך מסנן 0.22 μm. Equilibrate עמודה 120 מ ל S עם מאגר קורות חיים של S 2 (20 מ”מ HEPES, 150 מ מ NaCl, pH 7.5, 0.5 מ מ TCEP MST או 20 מ מ טריס-HCl, 1 מ”מ DTT, pH 7 NMR) בספיקה של 1 mL/min משתמש של FPLC. להזריק החלבון E-ההקלטה מרוכז מ 2.2.5 אל העמודה, elute עם מאגר קורות חיים של S 1 בספיקה של 0.5 mL/min, איסוף השברים 1 מ”ל. זיהוי שברים המכיל חלבון עניין כמו בעבר. בריכת שברים המכיל כמויות חלבון הגבוה ביותר. ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר או להוסיף גליצרול 20% של החנות ב-80 מעלות צלזיוס ב aliquots קטן. 3. NMR שיטות הכנת הדוגמא NMR לטהר 15פראי-סוג התווית על-ידי N או חלבון R1914E E-ההקלטה כפי שתואר קודם לכן באמצעות 20 מ מ טריס-HCl, 1 מ”מ DTT, pH 7 כמו המאגר S עבור שלב 2.2.6. פתרונות מניות חלבון בדרך כלל בטווח של 0.3 עד 1 מ מ עם אמצעי אחסון של 1 מ”ל.הערה: חלבון יכול להיות מרוכז כדי > 100 מיקרומטר באמצעות a kDa MWCO 3, 5 מ ל אולטראפילטרציה צנטריפוגלי התקן להביא את הריכוז לתוך מגוון מתאים עבור הכנת הדוגמא. לטהר מדגם של חלבון VimRod ללא תווית באמצעות 20 מ מ טריס-HCl, 1 מ”מ DTT, pH 7 כמו המאגר S עבור שלב 2.1.10. בכרך האחרון של 500 µL, להוסיף חלבון E-ההקלטה פראי-סוג או מוטציה ריכוז הסופי של 100µM, תחמוצת דאוטריום (D2O) כדי ריכוז סופי של 10% (v/v) ו- DSS (חומצה 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic) כדי ריכוז סופי של 20 מיקרומטר. הבא אמצעי האחסון מדגם עד 500 µL באמצעות 20 מ מ טריס-HCl, 1 מ”מ DTT, pH 7. הכנה במדגם מייצג מתוארת בטבלה4.הערה: ppm 0 התהודה של DSS משמש כדי לכייל את המשמרות כימית 1H וכן עבור הפניה עקיפה של הכימיקל 15N משמרות של חלבון6. D2O משמש עבור האות נעל דאוטריום לשמור את ספקטרומטר פועלים ב שדה מגנטי קבוע נטו. לפצות מדגם השני של E-ההקלטה, D2O ו- DSS כמו השלב הקודם ולהוסיף VimRod ריכוז סופי של 50 מיקרומטר לפני שמכניסים את אמצעי האחסון עד 500 µL. להעביר את הדגימות µL 500 5 מ מ רחב מרעד לניסוי. הגדרת הניסוי NMR הפעל זרימת אוויר עם ההוצאה הפקודה “ej”; זה יביא את הדגימה מהמגנט. עכשיו, במקום את הדגימה בתוך ספינר על גבי המגנט על ידי פתיחת והכנס עם הפקודה “ij”. המתן עד מדגם המתיישבת בתוך המגנט לפני שתמשיך. ליצור dataset חדשה באמצעות הפקודה “edc” וטען רגיל 1H NMR פרמטרים על-ידי בחירת ניסוי “ZGPR” (איור 1). מלאו את השם, EXPNO (ניסוי מספר) והשדות PROCNO (נתונים מעובדים תיקייה מספר). בחר הממס בשדה “קבע הממס” ולחץ על “לבצע ‘getprosol'” כדי לקרוא probehead סטנדרטית והפרמטרים תלויי הממס (prosol). לנעול את הדגימה deuterated ממס, קרי, D2O, באמצעות הפקודה “נעל” ולהמתין עד סיומה גורף, משיגה את המנעול. לתקן את תדר התהודה של המגנט על-ידי כוונון המדגם באמצעות הפקודה כוונון אוטומטי “atma”. לפקח על העקומה התנודדות עד כוונון אוטומטי תושלם. הגבהה השדה המגנטי באמצעות TOPSHIM (הפקודה “topshim”). Shimming הוא תהליך של שינויים בשדה המגנטי כדי להשיג אחידות סביב המדגם. זה תרגול טוב כדי לאחסן את הערכים shim עם הפקודה “של wsh” ולקרוא אותם באמצעות “rsh” לפני topshim, אם באמצעות דגימות זהות או דומות. התאם את רווח מקלט עם הפקודה “rga” כדי להשיג את האות המרבי יחס לרעש. מניחים במרכז הספקטרום על ההיסט תהודה מים (o1) ולהגדיר את הדופק פרוטון 90 מעלות (p1) בעוצמה גבוהה באמצעות “calibo1p1”. לאסוף הפרוטון ספקטרום באמצעות האפס ללכת “zg” הפקודה ותהליך עם “efp” אשר כולל כפל מעריכית (“em”), אינדוקציה חינם דעיכה (FID) שילוב הרחבת קו, “רגל” פורייה טרנספורמציה של FID “pk” כדי להחיל שלב תיקון. להחיל את התיקון האוטומטי שלב “apk”, את התיקון האוטומטי בסיסית “absn” באמצעות פולינום ללא אפשרות שילוב. ליצור dataset חדש (כמו 3.2.2) עבור הניסוי SOFAST HMBC על-ידי בחירה “SFHMQC3GPPH” בניסוי. העתק ממוטב P1, O1 מן הפרוטון ספקטרום ואכלוס פולסים התלויים P1 באמצעות הפקודה “getprosol 1H p1 plw1”, כאשר p1 הוא הערך P1 אופטימיזציה ו- plw1 הוא רמת צריכת החשמל עבור P1. למטב את הקבוע CNST54 כדי להגדיר את ההיסט למשמרת כימי אמיד, CNST55 כדי להגדיר את רוחב הפס כדי להקיף את האזורים ספקטרלי של ריבית אשר מאפשר את רווח המקלט יהיה מיטבי (איור 2). לבחירת הפרמטרים האלה, לחלץ את FID הראשון (דעיכה אינדוקציה חינם) ספקטרום דו מימדי וחפשו את האות שנצפה להגדיר אותם. בנוסף, משתנים העיכוב הרפיה (D1), מספר סריקות (NS), ואת סריקות מזויף (DS) כדי לקבל אות מקובל רגישות עם הפקודה “אלף”, אשר מאפשר לך לסרוק כדי לפקח על איכות הנתונים בזמן אמת. לתעד את הספקטרום באמצעות אפס Go “zg”. עיבוד נתונים NMR קבע את הפרמטרים עיבוד לגודל של F2 ישיר (1H) ו- F1 עקיף (15N) מידות של הספקטרום באמצעות “סי F2 = 2048, F1 = 512” עם תחזית לינארית אופציונלי בממד עקיף (איור 3). בחר “QSINE” כמו פונקציית חלון והזן משמרת בל סינוס (חלטורה) של 2 כדי לעבד את ספקטרום דו מימדי. הזן את הפקודה “xfb” לעבד את הנתונים בשני הכיוונים עם פונקציית חלון והתמרת פורייה. השתמש בפקודה “apk2d” כדי לבצע את שלב אוטומטי תיקון בשני הכיוונים. אם תהליך אוטומטי לא להשיג רמה מספקת של שלב תיקון, לחלץ FIDs עם הפקודה “rser”, לחשב ערכים שלב 1 י עיבוד ולהחיל אותם לנתונים דו-ממדיים. תקן את התוכנית הבסיסית עם הפונקציה תיקון אוטומטי בסיסית “abs2” לנתונים דו-ממדיים. זה חל על פונקציה פולינום בין הערכים ppm מוגדר בפרמטרים של עיבוד, יפיקו קשת 2D לצורך ניתוח נוסף. אם מתכנן לבצע עיבוד סדרתי להשוואה של נתוני האינטראקציה עם מולקולה נוספת, לאחסן את הפרמטרים עיבוד עם הפקודה “wpar”, זוכר אותם עם “rpar”. בדרך זו שכל קבצי הנתונים יעובדו עם אותו בפרמטרים ובמשתנים לא יוכנסו עקב עיבוד הבדלים. ניתוח נתונים NMR הזן את הפקודה “pp” כדי להתחיל בתהליך של איסוף שיא. הגדר ppm טווח ומינימום בעוצמה/מספר מירבי של פסגות בהתבסס על פסגות הצפוי (איור 4). לחץ על אישור וודא את התוצאות על ידי בדיקה חזותית. אם יש צורך, הפעל מחדש התהליך עד התוצאות משביעות מתבסס על איכות ספקטרה. צור peaklist עם הפקודה “עמודים”.הערה: peaklist הזה מכיל נתוני גובה/שיא עוצמת כברירת מחדל שבאפשרותך לייצא למנסרה עוקבות, ניתן לקרוא על ידי תוכניות אחרות. שימו לב לשינויים עוצמות שיא או בתנועת כימי במאזן ספקטרום HSQC חלבון להצביע על אינטראקציה עם מולקולה נוספת. אם המולקולה אינטראקציה גדולה, לצפות הפחתות בעוצמות שיא יחד עם היעלמותו של כמה פסגות. לייבא את רשימת שיא את ערכת הנתונים הבאה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה “פסגות” ובחירה “ייבוא” עם לחץ נכון בחלון פסגות. דמיינו את הפסגות על הספקטרום, אם יש צורך להסיט אותם למיקומים חדשים. לחץ על “איפוס עוצמות” עבור “שולחן שלמה” כדי ליצור את peaklist עבור הקשת עם עוצמות (איור 5). רשימה זו שיא ויישא מעל את מידע המיקום מרשימת שיא מאוחסנות. לייצא את הרשימות שיא נתונים (datasets) שונות גיליון אלקטרוני או תוכנית אחרת מתמטיים לניתוח על-ידי בחירה בפונקציה “לייצא”. לחשב את השינוי שחל בעוצמות שיא עם הפונקציה “עוצמת שיא בעוצמתם ספקטרום מתחם/שיא בספקטרום חלבון” עבור כל שיא. הערכים ניתן להמיר אחוזי השינוי על ידי הכפלה של 100. שימו לב כי שיא אחסון שימושיים גם אמנם שיא עוצמות יותר קל למדוד פסגות הממוקמים קרוב אחד לשני, כפי שקורה בדרך כלל חלבונים עם צפיפות גבוהה של פסגות רחב יחסית. 4. MicroScale Thermophoresis (MST) הכנה של ליגנד חלבון E-ההקלטה להחליף את ליגנד לתוך מאגר תואם MST מאת dialyzing עד 800 μL של חלבון ביחידת הדיאליזה מיני 3.5 kDa הושעו ב- 1 ליטר של 20 מ מ. HEPES, pH 7.5, 10 מ מ NaCl, לערבב לאט ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לרכז את ליגנד באמצעות יחידת אולטראפילטרציה צנטריפוגליות (3 kDa MWCO) על ידי צריך שתוציאו ב g 14 000 x במשך 10 דקות חלבון מרוכז להעברת צינור נקי. Centrifuge של ליגנד ב g 21,000 x 10 דקות ולהעביר בזהירות את תגובת שיקוע צינור כדי להסיר כל חלבון precipitated. לקבוע את ריכוז ליגנד באמצעות את ספיגת ב 280 ננומטר, המקדם הכחדה ליגנד. להוסיף 10% Tween-20 לתת בריכוז סופי 0.015%. Tween-20 נוסף למאגר assay כדי למנוע ספיחה הנימים. המאגר הסופית assay המשמשת עבור הניסויים MST הינו 20 מ מ HEPES, pH 7.5, 10 מ מ NaCl, 0.015% Tween-20. הכנת התווית על-ידי צבע היעד חלבון VimRod לשקם את הצבע האדום-טריס-נ על-ידי הוספת μL 50 של x 1 PBS-T שסופק עם האדום-טריס-נ לתת ריכוז 5 μM. לוותר על 2 μL aliquots לתוך צינורות μL 200 ולאחסן ב-20 ° C. לדלל את חלבון המטרה כדי μM 0.34 עם מאגר וזמינותו. להוסיף μL 58 של יעד aliquot 2 μL של צבע אדום-טריס-נ, תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. הריכוז הסופי של התווית על-ידי צבע היעד הוא 0.33 μM. Centrifuge המטרה שכותרתו 21,000 g x 10 דקות ולהעביר בזהירות את תגובת שיקוע צינור כדי להסיר כל המשקע. הצבע האדום-טריס-נ נקשר חלבונים באמצעות התג His6 ויש לו קבוע דיסוציאציה מחייב (דK) בטווח תת-nanomolar. הוא יעיל 100% חייב את חלבון המטרה אז אין טיהור נוספת נדרשת. להפעיל את המכשיר MST ופתחו את תוכנת שליטה. בחר את הגדרת אדום עבור הצבע האדום-טריס-נ. ת. הפעל את בקרת טמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס. בחר את Pretest כדי לאמת תיוג של היעד ולבדוק צבירה או ספיחה וואקום. הערכה של פרמטרים אלה ניתנת אוטומטית. ΜL מיקס 17 של מאגר assay, 3 μL של חלבונים היעד, מיקס על ידי pipetting. למלא שני נימים סטנדרטי על ידי טובלים אותם בתוך המטרה מדולל וניסוח נוזל אל מרכז נימי. הניחו נימים במגש, ואת לתוך כלי הנגינה. להתחיל את המדידה. סקור את התוצאות מחפש לרמה מספקת של זריחה, אין סימנים של ספיחה (עיוות בצורת קו נימי) או צבירת (העיוותים המעקב MST) אשר תסומן בניתוח תוכנה. אם התוצאות הן מהלך חיובי לליגנד השלבים, אם לא מאגר שונים צריך להישפט או ניתן להגדיל את כמות Tween-20 ל- 0.05% ומעלה. הכנה של הסדרה כפולה דילול של ליגנד E-ההקלטה להכין סדרה דילול על ידי תיוג 16, צינורות μL 200 מ 1-16. להוסיף μL 17 של ליגנד 1.17 x ריכוז גדול יותר מאשר הריכוז ליגנד המרבי הרצוי Tube1. אמצעי אחסון זה הוא פעמיים את הסכום הדרוש (8.5 μL) כמו aliquot ואז יועברו אל הצינור הבא בסדרה. הנפח הסופי של וזמינותו היא 10 μL μL 8.5 של 1.17 x ריכוז של ליגנד להיות מדולל ל- 1 x על ידי תוספת של 1.5 μL של החלבון היעד, VimRod. זה הריכוז המרבי שנבחרו צריך להיות לפחות 20 פעמים הערך KD המשוער. הוסף את μL 8.5 assay המאגר באמצעות טיפ פיפטה חדש עבור כל aliquot 16-Tubes2. שימוש חוזר פיפטה טיפים יכולים להשפיע על הדיוק (עבור ייעוץ מדויק pipetting ראה הוראות היצרן). העברת μL 8.5 של ליגנד מ Tube1 כדי Tube2 לאט לשחרר את הפתרון למאגר assay ללא יצירת בועות. מערבבים את ליגנד ואת מאגר על-ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 6 פעמים, שוב ללא יצירת בועות. E-ההקלטה בצינור מרוכז ביותר היה 1.5 מ מ, VimRod שכותרתו היה נוכח ריכוז סופי של 50 ננומטר. להעביר μL 8.5 של ליגנד Tube2 Tube3 ומערבבים עם המאגר וזמינותו. חזור על דילול טורי עד לכל הצינורות היו ליגנד נוסף. להתעלם μL 8.5 מ Tube16 כך לכל הצינורות מכילים μL 8.5 של ליגנד בסדרה של דילולים כפולה. הכנה של הניסוי מחייב תגובה ו- MST להוסיף 1.5 μL של החלבון היעד שכותרתו לכל אחד הצינורות ולערבב בעדינות על-ידי pipetting למעלה ולמטה וישתדלו להימנע בועות. תקופת דגירה של 15 דקות. לבחור את מצב מומחה איגוד וזמינותו והזינו בפרמטרים של סדרה דילול טורי. ודא בקרת טמפרטורה מוגדרת עד 25 ° C, הכוח עירור מוגדר 40%, ואת הכוח MST בינוני. פרמטרים אלה חייבים להיות אופטימיזציה עבור שותפים אחרים מחייב נחקר. מילוי הנימים עם תגובות איגוד ומניחים במגש נימי. לטעון את המגש לתוך הכלי, לחכות הטמפרטורה להשיב 25 ° C, ולהתחיל את המדידה. ניתוח נתונים פתח את הקובץ וזמינותו מחייבת בתוכנת ניתוח זיקה. סקור את הסריקות נימי; רמות קרינה פלואורסצנטית לא אמור להשתנות יותר מ-10% מן הממוצע, אין צבירה או ספיחה שיזוהו כמתואר בסעיף 3.6. בחר את הניתוח MST בלוח השמאלי וגרור את הנתונים assay לתוך ערכת ניתוח. אם קיימים מספר ריצות של היעד-ליגנד באותו איגוד וזמינותו בתנאים זהים הם ניתן למזג על ידי אותה קבוצה. לחלופין, כל הפעלה יכול להיות ירד לתוך ניתוח באופן עצמאי. להעביר את הכרטיסייה מינון תגובה מתאימה לגרף את הנתונים. בחר את דגם KD אם אתר איגוד יחיד צפוי. המודל היל הוא גם אופציה עבור מספר אתרי קישור עם ההתנהגות השיתופית. חריג חשוד טעות נקודות זה לא עבר בקרת איכות ניתן להסיר את התאמת בשלב זה. מיזוג קבוצות עם מבחני מרובים ייכללו בממוצע, שגיאות מחושבת סטיית התקן. פתיחת הכרטיסיה הסופית ולהשוות את התוצאות בין כל החלקות על גרף יחיד. לאחזר תוצאות המדידה כל עקומה מהטבלה שנוצר. לייצא את הנתונים או עקומות מצויד לתוכנות אחרות מצגת או ניתוח במקרה הצורך.