Nous présentons ici un protocole pour la production et la purification des protéines qui sont marqués avec des isotopes stables et ultérieure caractérisation des interactions protéine-protéine à l’aide de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) et micro-échelle Expériences de thermophorèse (MST).
Protéines filamenteuses Comme vimentine fournissent répète d’organisation au sein de cellules en fournissant un échafaudage structurels avec les sites permettant de lier des protéines contenant des plakin. Ici, un protocole pour la détection et la mesure de ces interactions est décrite en utilisant le domaine globulaire plakin d’envoplakin et la bobine hélicoïdale de vimentine. Cela fournit une base pour déterminer si une protéine lie vimentine (ou protéines filamenteuses similaires) et mesure de l’affinité de l’interaction. La protéine globulaire d’intérêt est étiquetée avec 15N et titrée avec la vimentine protéine en solution. Un spectre de RMN bidimensionnel est acquis pour détecter des interactions en observant les changements dans la forme de pic ou déplacements chimiques et élucider les effets des conditions de solution, y compris les niveaux de sel, qui influencent la structure quaternaire de vimentine. Si la protéine d’intérêt lie le ligand filamenteux, la réaction de liaison est quantifiée par MST en utilisant les protéines purifiées. L’approche est un moyen simple pour déterminer si une protéine d’intérêt lie à un filament et d’évaluer l’incidence des altérations, comme les mutations ou les conditions de la solution, sur l’interaction.
Interactions entre les protéines permettent la formation des machines moléculaires qui créent l’ordre à l’intérieur des cellules. Les interactions individuelles sont souvent faibles mais contribuent généralement à multivalents complexes qui peuvent être coopératif et dynamiquement réglementé. Les épreuves sensibles qui fournissent la résolution atomique et des informations quantitatives sur ces interactions complexes sont nécessaires pour déduire les mécanismes et concevoir des interventions comme la drogue-comme des molécules. Spectroscopie RMN est une méthode efficace pour obtenir les informations sur les interactions entre protéines et est aussi utilisée pour le dépistage rapide des ligands y compris ceux qui se lient faiblement1. Les méthodes de RMN utilisés peuvent être classés en ceux qui sont les protéines observer ou observer de ligand. Ce manuscrit utilise l’ancienne approche dans laquelle un spectre d’une protéine qui est relativement faible (généralement sous 20 kDa) marquée des isotopes stables est acquise et le ligand non étiqueté est titré. Ceci permet les résidus étiquetées impliqués dans l’interaction à mapper dans les cas favorables. Une fois les formes complexes, il y a des changements dans les environnements chimiques des résidus interdépendants qui se manifestent par des changements dans le déplacement chimique et la forme de leurs signaux de RMN. L’ampleur de ces changements est corrélée avec le degré d’implication de ces groupes dans l’interaction. Perturbations de déplacement chimique (EFPC) peuvent être mesurées en comparant une série de spectres RMN de la protéine recueillies en absence et en présence de quantités variables du ligand. Pour les plus gros ligands ou interactions complexes, le changement de forme de la pointe ou l’intensité peut être mesuré pour déduire des interactions.
L’expérience 2D couramment utilisé pour la détection des interactions ligand est le 15N-hétéronucléaire corrélation (HSQC) quantique unique expérience2. Cela exige qu’une protéine être uniformément étiquetés avec 15N, qui est généralement réalisé en les exprimant en tant que versions affinité-tag dans les cultures bactériennes Escherichia coli en 15médias enrichis en N. La liaison est apparente lorsque les spectres HSQC recueillis durant le titrage sont superposent, révélant les changements de pointe pour un sous-ensemble de résidus impliqués dans la formation du complexe. L’interaction peut se produire dans le régime d’échange rapide où les signaux de l’État libre et saturée en ligand sombrer dans une population moyenne de crête. Par ailleurs, dans le cas d’échanges lents entre les États, les deux signaux est observés avec intégrales qui représentent leurs quantités relatives. Analyse lineshape RMN peut être utilisés pour estimer les affinités de liaison dans certains cas, des méthodes telles que MST se sont également révélés commodes et fournissent une validation croisée de véritables interactions.
L’exemple fourni est de deux protéines retrouvées dans les desmosomes. Ils véhiculent des jonctions entre les surfaces de la cellule et le cytosquelette et médient MULTIVALENTES interactions entre les machines d’adhérence cellulaire et des filaments intermédiaires pour maintenir l’intégrité de la peau et les tissus cardiaques et résister à des forces de cisaillement. Maladies peuvent se produire lorsque desmosomes protéines comme desmoplakine ou vimentine sont compromises par les mutations ou les auto-anticorps, conduisant à la déstabilisation des jonctions cellule-cellule, et leurs interactions sont donc d’une importance cruciale,3. La base structurelle de liaison du ligand par des desmosomes protéines peut être caractérisée par la spectroscopie RMN, tandis que les interactions peuvent être quantifiées en MST. Méthodes ci-après ont été utilisées pour caractériser les interactions entre domaines de répéter plakin (PRDs) qui sont souvent présents sous forme d’ensembles de tandem qui offrent des rainures base et vimentine, un filament intermédiaire qui interagit à travers une surface acide offerte par son hélice forfait4. Ces complexes sont formées à la membrane cellulaire où ils l’ancre pour les filaments intermédiaires du cytosquelette cellulaire aux desmosomes qui se connectent à des cellules adjacentes, formant ainsi un réseau de liaisons adhésifs qui rayonne dans un tissu.
Le 2D 15expérience N-résolu NMR est un du plus largement utilisé des méthodes pour montrer comment deux molécules interagissent. C’est la méthode de la plus riche en informations qui permet aux signaux des deux partenaires à être surveillée de façon continue tout au long d’une expérience de titrage en état de solution. Bien que généralement qualitatives dans le cas de grands complexes, la méthode peut aussi servir dans les cas favorables pour mesurer les affinités de liaison où les signaux RMN peuvent être suivis dans des spectres de haute résolution. Lorsque les attributions peuvent être effectuées facilement, comme dans le cas de beaucoup de protéines sous 20 kDa dans la taille, les sites de fixation peuvent aussi être mappés. Des tests complémentaires comme MST fournissent des informations quantitatives sur les interactions en solution et exigent moins de protéines dans les États sans étiquette. Comparaison de mutant de liaison de données est utile pour fournir des contrôles pour s’assurer que les interactions mis en évidence par l’élargissement des raies de NMR sont authentiques et pas d’artefacts de, par exemple, des changements de viscosité ou de l’agrégation.
Expression de la protéine
Rationalisation du processus d’expression réduit la quantité de production de protéines intensive de travail. Cadre de ce processus d’optimisation implique l’identification d’une souche appropriée d’Escherichia coli d’expression de la protéine recombinante. Préférence de souche dépend des éléments, y compris la nature du vecteur en cours d’utilisation et, plus précisément, la stabilité ultime de la protéine recombinante est exprimé7. Le risque de dégradation de la protéine hétérologue par endogène d’e. coli protéases peuvent être réduits par l’utilisation de protéase déficient e. coli comme la souche BL21. Gènes contenant des codons rares, une souche comme RIPL BL21-CodonPlus (DE3) peut être privilégiée. Cette souche allie la nature déficiente de protéase de la souche BL21 des exemplaires supplémentaires d’endogènes des ARNt codons rares pour l’arginine, isoleucine, proline et la leucine. Alternativement, les codons rares qui peuvent compromettre la surexpression peuvent être évités en ordonnant une construction optimisée codon provenant d’une source commerciale. De nombreuses souches d’Escherichia coli sont disponibles pour l’expression du gène recombinant, chacun optimisé pour le contournement d’un problème au cours de l’expression7. Dans le cas de cette étude, la souche déficiente en protéase standard BL21 (DE3) produit en quantité suffisante de protéine soluble pour purification ultérieure et l’analyse.
Purification de protéine
Le protocole de purification d’une protéine donnée est souvent unique en ce sens que chaque protéine reste stable et soluble dans des conditions différentes telles que température, concentration en sel ou pH. L’efficacité globale de purification par chromatographie d’affinité est également sensible à la concentration des espèces élution comme imidazole à différentes étapes au cours du processus de purification. Dans ce travail, les conditions de tampon critique pour IMAC étaient pH pour le E-PRD et concentration imidazole pour le VimRod. Un pH de 7.5 devait éviter la précipitation du PRD-E après élution initiale de la colonne de l’IMAC. Pour la purification de l’IMAC de VimRod, augmentation de la concentration de l’imidazole de 30 à 50 mM au cours de l’étape de lavage de colonne s’est avéré pour avoir une amélioration substantielle dans la pureté des fractions d’élution finale. Pour l’étape d’élution, augmentation de la concentration de l’imidazole de 250 à 350 mM s’est avéré pour améliorer le rendement de l’élution finale. Les premières tentatives pour éluer les protéines à l’aide d’imidazole de 250 mM a conduit à l’élution incomplète du VimRod telle que révélée par une bande d’imidazole 1 M final de la colonne (données non présentées). Augmentation de la concentration de l’imidazole à 350 mM pour l’élution suffisait récupérer l’ensemble de la protéine liée à la colonne. S pouvant servir un double objectif, car il agit comme une étape de polissage pour la purification de protéines tout en effectuant simultanément change de tampon. Change de tampon est une étape essentielle pour l’analyse ultérieure de liaison car il supprime l’imidazole utilisé pour Éluer la protéine His6-étiquetée. Il sert également une occasion de changer les conditions telles que la concentration en sel ou pH, ce qui peut affecter l’efficacité de certaines techniques en aval ou essais. Protéine décalage thermique (PTS) peut être utilisé pour identifier les tampons optimales pour les tests en aval, en particulier pour ceux qui ont besoin de protéines stable pour de longues périodes de temps à la température de la pièce8,9.
Analyse de liaison
Protéine qui est fraîchement préparé est critique pour essais de liaison exacte, bien que la protéine congelé peut également être utilisé tant que les résultats sont comparés. Les protéines filamenteuses Comme vimentine multimerize d’une manière dépendante de sel et pH, et par conséquent la solution il fallait être optimisé et l’État oligomère estimée par une méthode telle que SEC10,11, dynamique de diffusion de lumière 12 ou ultracentrifugation analytique13,14,15. Spectroscopie RMN est bien adaptée pour la mesure des interactions ligand de petites protéines à résolution atomique. Cependant, quand une protéine interagit avec une molécule plus grande, il s’ensuit un culbutage plus lent et cela se traduit par la perte des signaux qui peuvent confirmer liaison, bien qu’il ne le fait pas nécessairement permettre cartographie des sites, ce qui nécessitent également affectation d’au moins de fixation dorsale résonances. Dans ce scénario, des expériences RMN ne permettent pas d’identifier le site de l’interaction. Donc site réalisé mutagénèse est appliqué pour identifier les résidus importants nécessaires pour la liaison. C’est pourquoi ces mutants ne présentent pas de perte de signal. Dans ce protocole, une forme mutante avec une substitution en position 1914 conserve les intensités maximales en présence de VimRod et confirme donc la perturbation de l’interaction des E-PRD et VimRod. Affectation des résonances épine dorsale et sidechain ajouterais valeur à cette approche, en particulier comme la structure pour le PRD-E libre a été résolue par cristallographie aux rayons x4. Futures applications de la RMN comprennent la caractérisation des interactions complexes entre les molécules plus grosses et bénéficieront d’ultra hautes aimants de champ et l’utilisation des autres groupes observables telles que 13C-étiquetés et groupes méthyles trifluoro comme journalistes.
MST a un certain nombre d’avantages pour l’étude des interactions de liaison16. Les partenaires de liaison sont libres en solution et pas immobilisées. Analyse de la qualité des échantillons est intégré dans le logiciel avec contrôle de la qualité reporting d’agrégation, l’adsorption sur les capillaires ou marquage fluorescent insuffisante de la molécule cible. De petites quantités de la cible sont généralement utilisés, la concentration de la cible marquée est généralement entre 20 et 50 nM en 10-20 μL volume/réaction. Ce protocole utilise des volumes de réaction très faible (10 μL) afin d’optimiser la concentration de ligand qui peut être réalisé dans les titrages permettant des interactions de liaison faible à caractériser. Cela exige que l’on précise pipetage et prenant soin d’éviter d’introduire des bulles tout en mélangeant toujours soigneusement. Un mélange adéquat est essentiel pour les mesures de fluorescence précise et uniforme le long de la série de dilutions en série. Le montant de Tween-20 dans les expériences de MST a été réduit à une norme de 0,05 % à 0,015 % pour réduire la tendance à créer des bulles et d’améliorer le mélange.
Le colorant rouge-Tris-NTA offre un moyen rapide, facile et pratique d’étiqueter fluorescent toute protéine qui a un son tag. L’étiquetage est effectivement terminé en 30 minutes seulement et est très serré de sorte qu’aucune procédure de retrait de colorant n’est nécessaire. Aucune modifications ne sont apportées aux résidus d’acides aminés dans la protéine qui seraient susceptibles de modifier les propriétés de liaison du ligand. Une mise en garde est que seulement les protéines doivent être étiquetées doivent avoir une balise His6. Cela nécessitait le clivage de la balise de la protéine ligand, E-PRD et la suppression de la balise et clivé E-PRD avec une deuxième étape de colonne IMAC. Si possible, la protéine ligand doit être préparée sans l’utilisation d’une balise. Alternativement, protéines peuvent être étiquetés de façon covalente avec un fluorophore par amine coupler à des résidus de lysine ou thiol de couplage pour les résidus de cystéine. Cependant, il faut quand à l’aide de ces systèmes depuis la fixation covalente d’un fluorophore peut-être affecter les interactions de liaison électrostatique ou polaire en s’appuyant sur les résidus de lysine ou la cystéine. La quantification de l’affinité entre les VimRod et les E-PRD de MST a été particulièrement sensible à la concentration de sel. Ce problème a été atténué par dialyse initialement la cible et le ligand dans le même lot de tampon. Néanmoins, saturation de la courbe de liaison MST ne pourrait être atteint que lorsque vous effectuez les tests de MST en présence de NaCl 150 mM en raison du comportement complex de VimRod. Données fiables et complètes a été obtenues une fois que la concentration de NaCl a été abaissée à 10 mM, ce qui permet un calcul précis de la KD. Donc, optimisation minutieuse des conditions de la solution et comparaison avec des analyses complémentaires sont recommandés afin d’atteindre des résultats robustes. En outre, les MST peut-être servir à quantifier la dépendance de sel pour une interaction donnée, de quantifier les propriétés stoechiométriques des interactions protéine, moniteur le repliement des protéines et de la sonde en enzyme cinétique17.
The authors have nothing to disclose.
Ce projet a été soutenu par le CRSNG RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-002-12 C) et l’Alberta Prion Research Institute / Alberta Innovates Bio Solutions (201600018), attribué à tibus et Génome Canada, Fondation canadienne pour Subventions de l’innovation décernées à la métabolomique Innovation Centre (ICTM) et NANUC.
Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |