Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

(1) rekombinante Proteinexpression Ausdruck von Envoplakin PRD (E-PRD) und Vimentin 99-249 (VimRod) E. Coli BL21(DE3) Zellen mit dem Plasmid enthält das gewünschte gen zu verwandeln. Die Zellen auf Agarplatten mit 100 µg/mL Ampicillin zu verbreiten. Über Nacht inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C. Wählen Sie eine einzelne Kolonie und impfen Sie 20 mL Super Brühe (TB), enthält 100 µg/mL Ampicillin, wählen für das Plasmid zu. Wachsen Sie die Kultur bei 37 ° C mit schütteln (180 u/min) über Nacht. Übertragen Sie die gesamten 20 mL Kultur auf 1 L des TB mit 50 µg/mL Ampicillin. Inkubation die Kultur bei 37 ° C mit Schütteln bei 180 u/min bis die OD600 = 0,6-0,8. Reduzieren Sie die Temperatur auf 18 ° C und induzieren Sie Protein-Expression durch Zugabe von Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG), eine Endkonzentration von 1 mM zu. Weiter Inkubation bei 18 ° C mit Schütteln bei 160 u/min über Nacht Proteinexpression ermöglichen. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren der Kultur bei 8.000 x g für 15 min. Dekantieren und den Überstand verwerfen. Waschen der geernteten Zellen durch resuspending der Zelle Pellet in ca. 40 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS: 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 120 mM NaCl). Übertragen Sie die Wiederfreisetzung auf eine 50 mL-Tube. Zentrifuge wieder bei 8.000 x g für 15 Minuten. Dekantieren und den Überstand verwerfen. Sofort beginnen Sie die Reinigung-Protokoll oder frieren Sie die Zelle Pellets bei-20 ° C zur späteren Verwendung ein. Expression von isotopisch beschriftete Protein Verwandeln Sie E. Coli BL21(DE3) Zellen zu, und bereiten Sie eine 20 mL Starterkultur wie in 1.1.1-1.1.2. Übertragen Sie die gesamten 20 mL Kultur auf 1 L des angereicherten TB mit einer zusätzlichen 4,0 g Tryptone, 5,0 g NaCl und 100 µg/mL Ampicillin. Inkubation die Kultur bei 37 ° C mit Schütteln bei 160 u/min bis die OD600 = 1,6 – 1,9. 1 L Kultur durch Zentrifugation bei 8000 X g für 15 min. Dekantieren ernten und den Überstand verwerfen. Waschen Sie die Zelle Pellet durch sanft resuspending in ca. 40 mL PBS und übertragen Sie die Wiederfreisetzung auf eine 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie wieder bei 8.000 x g für 15 min. Dekantieren und verwerfen Sie den überstand. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 20 mL M9 minimal Medien (Tabelle 1) und die Übertragung auf den Rest des 950 mL M9 minimal Medien enthält 100 µg/mL Ampicillin. Fügen Sie 50 mL Filter sterilisiert Nährstoff-Mix (Tabellen 2 und 3). Akklimatisieren Sie die Kultur auf 18 ° C für 30 min bevor Sie hinzufügen eine Endkonzentration von 1 mM IPTG. Über Nacht bei 18 ° C mit Schütteln bei 160 u/min inkubieren. Ernten Sie die Zellen wie in Abschnitt 1.1.4-1.1.6. (2) immobilisiert Metall Affinität Chromatographie (IMAC) Reinigung des VimRod und des E-PRD Reinigung des His6-Tags VimRod Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL/g von PBS, eine Protease Inhibitor cocktail fehlen EDTA enthalten. Homogenisieren Sie mit 12 Schlägen in einem Dounce Gewebe Homogenisator, die Zelle Lyse im folgenden Schritt zu verbessern. Auf dem Eis beschallen die Zellsuspension auf einen Impuls von 1 s/1 s aus, 80 % Amplitude für eine Gesamtmenge von 1,5 min. wiederholen die Beschallung zwei zusätzliche Zeiten, wirbelnden sanft auf Eis zwischen läuft, um eine Überhitzung zu verhindern. Zentrifugieren Sie die Probe auf 75.000 x g für 45 min. Dekantieren und Filtern des Überstands mit einer Spritze Filter (0,45 µm). Equilibrate eine 5 mL-IMAC-Säule mit 5 Spalte Volumen (CV) der Bindung Puffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min mit einem schnellen Protein Flüssigkeitschromatographie (FPLC) System. Laden Sie die gefilterten Überstand auf die Säule mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min. Waschen Sie die Spalte mit 5 CV von waschen Puffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 50 mM Imidazol) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min. Das Protein mit 3 eluieren CV der Elution Puffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 350 mM Imidazol) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mL/min sammeln 1,5 mL Fraktionen. Falls vorhanden, wählen Sie den Up-Flow Elution Modus um die Konzentration der eluierten Proteins zu erhöhen. Identifizieren Sie die Fraktionen aus der FPLC Chromatogramm, die enthalten des Proteins des Interesses durch SDS-PAGE und standard-Methoden verwenden, um die Protein-Konzentration-5messen. Bündeln Sie und konzentrieren Sie die Elution Brüche mit den höchsten Mengen an Protein mit einem zentrifugalen Ultrafiltration Gerät (MWCO 3 kDa, 5 mL), 2 mL. Zentrifugieren Sie bei 21.000 x g jeder Niederschlag zu entfernen und durch einen 0,22-μm-Filter übergeben. Eine 120 mL Größe Ausgrenzung (S) Chromatographiesäule mit 2 CV S Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM DÄMMUND) bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min mit einem FPLC Equilibrate. Das konzentrierte Protein aus 2.1.9 auf die Säule zu injizieren und eluieren mit 1 CV S-Puffer mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min, 1 mL Fraktionen zu sammeln. Identifizieren Sie die Brüche, enthält das Protein des Interesses als vor. Bündeln Sie die Fraktionen, die die höchsten Mengen Eiweiß enthalten. Lagerung bei 4 ° C für den kurzfristigen Einsatz oder 20 % und bei-80 ° C in kleinen Aliquote Glycerin hinzufügen. Reinigung des E-PRD Protein mit dem His6 Tag entfernt Folgen Sie den Schritten im 2.1.1-2.1.8 His6 tagged E-PRD Protein zu reinigen. Die Peak-Fraktionen bündeln und Konzentration des Proteins zu bestimmen. Fügen Sie Tabak Ätzen Virus (TEV) Protease (1 mg/mL) bei 2 µL/mg gepoolten Protein. Transfer zur Dialyse (6 kDa) Schläuche und Dialyse in S Puffer über Nacht bei 4 ° c Dieser Schritt ermöglicht es Spaltung des His6 Tags und Entfernung von Imidazol, die Bindung an das Ni-NTA-Harz im nächsten Schritt stören wird. Equilibrate 5 mL Ni-NTA-Harz in einer Schwerkraft-Spalte mit 3 CV S Puffer. Abfluss überschüssigen Puffer aus dem Harz. Gießen Sie das gespalten E-PRD-Protein auf das Harz und inkubieren Sie für 1 Stunde auf eine rockende Plattform, uncleaved His6 tagged E-PRD und gespalten His6 Tag zu binden. Der TEV-Protease ist auch His6 markiert und wird das Harz zu binden. Sammeln der Durchströmung, die enthält die Tag-freie E-PRD. Waschen des Harzes mit 2 CV S Puffer, um sicherzustellen, dass alle E-PRD wird wiederhergestellt. E-PRD in der Durchströmung zu 2 mL mit einem zentrifugalen Ultrafiltration Gerät (MWCO 3 kDa, 5 mL) zu konzentrieren. Zentrifugieren Sie bei 21 000 x g jeder Niederschlag zu entfernen und durch einen 0,22-μm-Filter übergeben. Eine 120 mL S Spalte mit 2 CV S Puffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM DÄMMUND für MST oder 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 für NMR) mit einer Durchflussrate von 1 mL/min mit einem FPLC Equilibrate. Das konzentrierte E-PRD-Protein aus 2.2.5 auf die Säule zu injizieren und eluieren mit 1 CV S-Puffer mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min, 1 mL Fraktionen zu sammeln. Identifizieren Sie die Brüche, enthält das Protein des Interesses als vor. Bündeln Sie die Fraktionen, die die höchsten Mengen Eiweiß enthalten. Lagerung bei 4 ° C für den kurzfristigen Einsatz oder 20 % und bei-80 ° C in kleinen Aliquote Glycerin hinzufügen. (3) NMR Methoden NMR-Probenvorbereitung 15N-mit der Bezeichnung Wildtyp oder R1914E E-PRD Protein wie zuvor beschrieben, mit 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH-Wert 7 als die S-Zwischenspeicher für Schritt 2.2.6 zu reinigen. Protein Stammlösungen reichen in der Regel von 0,3 bis 1 mM mit einem Volumen von etwa 1 mL.Bemerkung: Protein kann auf > 100 µM mit einem MWCO 3 kDa, 5 mL zentrifugale Ultrafiltration Gerät bringen die Konzentration in einem geeigneten Bereich für die Probenvorbereitung. Eine Probe der unbeschrifteten VimRod Protein mit 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH-Wert 7 als die S-Zwischenspeicher für Schritt 2.1.10 zu reinigen. Fügen Sie in einem Endvolumen von 500 µL Wildtyp oder mutierte E-PRD-Protein eine Endkonzentration von 100µM, Deuteriumoxid (D2O), eine Endkonzentration von 10 % (V/V) und DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic Säure), eine Endkonzentration von 20 µM. Bring Das Probenvolumen bis zu 500 µL mit 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. Eine repräsentative Stichprobe Vorbereitung ist in Tabelle 4beschrieben.Hinweis: 0 ppm Resonanz des DSS wird verwendet, um die 1H chemische Verschiebungen zu kalibrieren, sowie für die indirekte Referenzierung der 15N chemischen Verschiebungen von der Protein-6. D2O wird für das Deuterium-Sperre-Signal verwendet, um das Spektrometer auf ein konstantes Magnetfeld net zu halten. Eine zweite Probe von E-PRD, D2O und DSS wie im vorherigen Schritt machen und eine Endkonzentration von 50 µM vor einer Klage das Volumen bis zu 500 µL VimRod hinzufügen. Übertragen Sie die 500 µL Proben auf einen 5 mm breiten NMR Röhrchen für das Experiment. NMR-Versuchsaufbau Schalten Sie den Luftstrom mit dem Auswerfen Befehl “Ej”; Dies öffnet die Probe vom Magneten. Nun legen Sie die Probe in ein Spinner auf den Magneten durch die Öffnung und setzen Sie mit dem Befehl “Ij”. Warten Sie, bis die Probe setzt sich im Inneren des Magneten, bevor Sie fortfahren. Erstellen Sie ein neues Dataset mithilfe des Befehls “Edc” und laden Sie standard 1H NMR Parameter wählen Sie Experiment “ZGPR” (Abbildung 1). NAME, EXPNO (Experimentnummer) und PROCNO (verarbeiteten Daten Ordnernummer) Felder ausfüllen. Wählen Sie das Lösungsmittel im Feld “Set Lösungsmittel” und klicken Sie auf “Ausführen ‘Getprosol'” standard Probehead und Lösungsmittel (Prosol) Parameter zu lesen. Verriegeln Sie die Probe auf die deuterierte Lösungsmittel, z. B. D2O, mit Befehl “Sperren” und warten Sie, bis es fertig ist pauschal und Sperre erreicht. Korrigieren Sie die Resonanzfrequenz des Magneten durch tuning der Probe mit dem automatischen tuning-Befehl “Atma”. Überwachen Sie die Wobble-Kurve, bis die automatische Abstimmung abgeschlossen ist. Shim das Magnetfeld mit TOPSHIM (Befehl “Topshim”). Shim ist Anpassungen, Magnetfeld, Gleichmäßigkeit um die Probe zu erreichen. Es empfiehlt sich, die Shim-Werte mit dem Befehl “Wsh” speichern und lesen Sie sie mit “Rsh” vor Topshim, wenn die gleiche oder ähnliche Beispiele verwenden. Passen Sie die Empfänger-Verstärkung mit “Rga”-Befehl, um maximale Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Legen Sie der Mitte des Spektrums auf der Wasser-Resonanz-Offset (o1) und legen Sie die 90-Grad-Proton-Puls (p1) bei hoher Leistung mit “calibo1p1”. Sammeln der Proton-Spektrum mit der Null gehen “Zg” Befehl und Prozess mit “Efp” umfasst exponentielle Vermehrung (“Em”), die freie Induktion Decay (FID) Einbeziehung Linie zu erweitern, “ft” Fourier-Transformation der FID und “Pk” Phase anwenden Korrektur. Gelten Sie die automatische Phase Korrektur “Apk” und die automatische Basislinienkorrektur “Absn” über das Polynom ohne Integrationsmöglichkeit. Erstellen Sie ein neues Dataset (wie in 3.2.2) für das SOFAST HMBC-Experiment durch Auswahl von “SFHMQC3GPPH” im Experiment. Kopie P1 und O1 von Proton Spektrum optimiert und P1 abhängigen Impulse mit Befehl “Getprosol 1H p1 plw1”, wo p1 ist der optimierte P1-Wert und plw1 ist die Leistungsstufe P1 zu füllen. Optimieren Sie die CNST54-konstante um den Offset für Amid chemische Verschiebung festzulegen und CNST55, die Bandbreite zu definieren, um den Spektralbereichen von Interesse zu erfassen, wodurch den Empfänger Gewinn sein optimiert (Abbildung 2). Um diese Parameter zu wählen, extrahieren Sie die erste FID (free Induction Decay) aus dem zweidimensionalen Spektrum zu und suchen Sie das beobachtete Signal, sie zu definieren. Darüber hinaus variieren Sie die Entspannung Verzögerung (D1), Anzahl der Scans (NS) und Dummy-Scans (DS) akzeptabel Signalempfindlichkeit mit Befehl “gs”, erhalten die ermöglicht gehen und scannen, um die Qualität der Daten in Echtzeit zu überwachen. Notieren Sie die Spektren mit Null Go “Zg”. NMR-Daten-Verarbeitung Festlegen der Verarbeitungsparameter auf die Größe des direkten F2 (1H) und indirekte F1 (15N) Dimensionen des Spektrums mit “SI F2 = 2048, F1 = 512” mit optionalen lineare Vorhersage in indirekte Dimension (Abbildung 3). Wählen Sie “QSINE” als die Fensterfunktion und geben Sie eine Sinus-Glocke-Verschiebung (SSB) 2, das zweidimensionale Spektrum zu verarbeiten. Geben Sie den Befehl “Xfb” zur Verarbeitung der Daten in beide Richtungen mit Fenster-Funktion und Fourier-Transformation. Verwenden Sie den Befehl “apk2d” automatische Phasenkorrektur in beide Richtungen durchführen. Wenn der automatische Prozess kein zufriedenstellendes Niveau der Phasenkorrektur erreicht, FIDs mit dem Befehl “Rser” extrahieren Phase Werte von 1D Verarbeitung zu berechnen und auf die 2D Daten anwenden. Korrigieren Sie die Grundlinie mit der automatischen Grundlinie Korrekturfunktion “abs2” für 2D Daten. Dies gilt eine Polynomfunktion zwischen der ppm-Werte in den Verarbeitungsparametern definiert und erzeugt ein 2D Spektrum zur weiteren Analyse. Falls Serienverarbeitung zum Vergleich von Interaktionsdaten mit einem anderen Molekül durchführen, speichern Sie die Verarbeitungsparameter mit dem Befehl “Wpar” und erinnern sie mit “aufgerufenen”. Auf diese Weise können alle Datensätze mit gleichen Parametern und Variationen verarbeitet werden werden nicht eingeführt werden, aufgrund der Verarbeitung unterschieden. NMR-Daten-Analyse Geben Sie die Befehl “pp” um mit der Spitze pflücken beginnen. Definieren Sie die ppm Bereich und mindestens Intensitätsmaximum/Anzahl der Peaks anhand der erwarteten Gipfel (Abbildung 4). Klicken Sie auf “OK” und überprüfen Sie die Ergebnisse durch Sichtkontrolle. Bei Bedarf erneut führen Sie aus, der Prozess bis Ergebnisse zufriedenstellend sind anhand von Spektren Qualität. Erzeugen Sie eine Peaklist mit dem Befehl “pp”.Hinweis: Dieses Peaklist enthält Daten Höhe/Peak Intensität Informationen standardmäßig und zur anschließenden Spektren exportiert werden kann und von anderen Programmen gelesen werden kann. Beobachten Sie Veränderungen in der Peak-Intensitäten oder Bewegung in chemischen Verschiebungen in den Protein-HSQC–Spektren, die Interaktion mit einem anderen Molekül angeben. Wenn die interagierende Moleküle groß ist, erwarten Sie Kürzungen in Spitzenzeiten Intensitäten zusammen mit Verschwinden der einige Gipfel. Importieren Sie die Peak-Liste auf den nächsten Datensatz durch Klicken auf die Registerkarte “Peaks” und “importieren” auswählen mit der rechten Maustaste im Fenster “Gipfel”. Visualisieren Sie die Gipfeln über das Spektrum und bei Bedarf an eine neue Position verschieben. Klicken Sie auf “Zurücksetzen Intensitäten” für “komplette Table”, eine Peaklist für das Spektrum mit Intensitäten (Abbildung 5) zu generieren. Dieser Gipfel-Liste wird über die Positionsinformation von gespeicherten Gipfel Liste durchführen. Exportieren Sie die Peak-Listen aus verschiedenen Datasets zu einem Tabellenkalkulationsprogramm oder anderen mathematischen Programm zur Analyse indem Sie die Funktion “Exportieren” auswählen. Berechnen Sie die Veränderung der Intensitäten der Peak mit der Funktion “Peak-Intensität in komplexen Spektrum/Peak-Intensität im Protein-Spektrum” für jeden Peak. Werte können in prozentuale Veränderung durch Multiplikation der 100 konvertiert werden. Beachten Sie, dass Peak Bände auch nützliche obwohl Peak Intensitäten einfacher sind zu messen für Gipfeln, die nah beieinander liegen, da in der Regel für Proteine mit einer hohen Dichte der relativ breiten Gipfel der Fall ist. 4. MicroScale Thermophorese (MST) Vorbereitung der Liganden Protein E-PRD Tauschen Sie den Liganden in einer MST-kompatibel-Puffer von dialyzing bis zu 800 μl des Proteins in einem 3,5 kDa Mini-Dialyse-Einheit in 1 L 20 mm HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, unter ständigem Rühren langsam bei 4 ° C über Nacht ausgesetzt aus. Die Liganden mit einer zentrifugalen Ultrafiltration-Einheit (3 kDa MWCO) durch Zentrifugieren bei 14 000 x g für 10 min. Transfer konzentrierten Proteins in ein sauberes Röhrchen zu konzentrieren. Die Liganden bei 21.000 x g für 10 min Zentrifugieren und sorgfältig übertragen des Überstands auf eine neue Röhre, jede ausgefälltes Eiweiß zu entfernen. Bestimmen die Konzentration des Liganden mit der Absorption bei 280 nm und dem Liganden Aussterben Koeffizienten. Fügen Sie 10 % Tween-20, eine Endkonzentration von 0,015 % zu geben. Tween-20 ergänzt die Testpuffer Adsorption zu den Kapillaren zu verhindern. Die endgültige Testpuffer, die für die MST-Experimente verwendet wird ist 20 mM HEPES, pH 7,5, 10 mM NaCl, 0,015 % Tween-20. Vorbereitung der Farbstoff-markierten Ziel Protein VimRod Bereiten Sie den rot-Tris-NTA-Farbstoff durch Zugabe von 50 μL 1 x PBS-T mit der rot-Tris-NTA zu einer Konzentration von 5 μM geliefert. 2 μl-Aliquots in 200 μl Tuben und Lagerung bei-20 ° C. Verdünnen Sie das Zielprotein, 0,34 μM mit Testpuffer. Ein 2 μL aliquoten rot-Tris-NTA Farbstoff 58 μL des Ziels hinzu und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Endkonzentration von Farbstoff-markierten Ziel ist 0,33 μM. Das markierte Ziel bei 21.000 x g für 10 min Zentrifugieren und sorgfältig übertragen des Überstands auf eine neue Röhre, jede Niederschlag zu entfernen. Der rot-Tris-NTA-Farbstoff bindet an Proteine durch die His6-Tag und hat eine verbindliche Dissoziationskonstante (K-D) im Sub-nanomolaren Bereich. Es ist effektiv zu 100 % an das Zielprotein gebunden, so dass keine weitere Reinigung erforderlich ist. Schalten Sie die MST-Instrument, und öffnen Sie die Steuerungs-Software. Wählen Sie die rote für die rot-Tris-NTA-Farbstoff. Schalten Sie den Temperaturregler auf 25 ° C. Wählen Sie den Pretest zu validieren, die Kennzeichnung des Ziels und Aggregation oder Adsorption an die Küvetten suchen. Eine Bewertung dieser Parameter wird automatisch bereitgestellt. Mix-17 μL Testpuffer und 3 μL Zielprotein und Mix von pipettieren. Füllen Sie zwei standard Kapillaren durch Eintauchen in das verwässerte Ziel und die Erstellung von Flüssigkeit in der Mitte der Kapillare. Platzieren Sie Kapillaren in das Fach und in die Instrumente. Starten Sie die Messung. Überprüfen Sie die Ergebnisse, die auf der Suche nach ein ausreichendes Maß an Fluoreszenz und keine Anzeichen der Adsorption (Verzerrung in der Kapillarleitung Form) oder Aggregation (Verzerrungen in der MST-Ablaufverfolgung), die in der Softwareanalyse gekennzeichnet werden. Wenn die Ergebnisse positiv sind an den Liganden Schritte, wenn keine andere Puffer muss ausprobiert werden oder die Höhe der Tween-20 kann erhöht werden, bis 0,05 % oder höher. Vorbereitung der Baureihe E-PRD Liganden zweifache Verdünnung Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe durch Kennzeichnung 16, 200 μL Tuben von 1-16. Fügen Sie 17 μL des Liganden bei 1,17 x höhere Konzentration als die maximale Liganden-Konzentration Tube1 wollte. Dieser Band ist doppelt so viel benötigt (8,5 μL) wie eine aliquote dann an das nächste Rohr hintereinander übertragen werden. Der letzte Band des Assays ist 10 μL so 8,5 μL 1,17 X Konzentration des Liganden auf 1 X durch Zugabe von 1,5 μL des Zielproteins, VimRod verdünnt werden. Diese maximale Konzentration gewählt sollte mindestens 20 Mal den geschätzten KD -Wert sein. Tubes2-16 mit einer neuen Pipettenspitze für jedes aliquoten fügen Sie 8,5 μL der Testpuffer hinzu. Wiederverwendung von Pipettenspitzen beeinflussen die Genauigkeit (für die Beratung über genaues Pipettieren siehe Herstellerangaben). Übertragen Sie 8,5 μL des Liganden von Tube1 an Tube2 langsam loslassen die Lösung in der Assay-Puffer ohne Luftblasen zu generieren. Mischen Sie die Liganden und Puffer durch Pipettieren oben und unten mindestens 6 mal wieder ohne Luftblasen erzeugen. E-PRD in der konzentriertesten Röhre 1,5 mM und die beschrifteten VimRod war an eine Endkonzentration von 50 nM. 8.5 μL Liganden von Tube2 auf Tube3 übertragen und mischen mit dem Assay-Puffer. Die serielle Verdünnung zu wiederholen, bis alle Röhren Liganden hinzugefügt haben. 8.5 μL aus Tube16 zu verwerfen, so dass alle Röhren 8,5 μL der Liganden in einer Reihe von zwei-Fach-Verdünnungen enthalten. Vorbereitung des verbindliche Reaktion und MST-Experiments Jedes der Rohre 1,5 μL der beschrifteten Zielprotein hinzu und mischen Sie leicht durch Pipettieren nach oben und unten, wobei Sie darauf achten, um Luftblasen zu vermeiden. 15 min inkubieren. Wählen Sie den Expertenmodus zum verbindlichen Test und geben Sie die Parameter für eine serielle Verdünnungsreihen. Stellen Sie sicher, Temperaturregler eingestellt auf 25 ° C, die Erregerleistung wird voraussichtlich 40 % und die MST macht, Medium. Diese Parameter müssen für andere Bindungspartner untersuchten optimiert werden. Füllen Sie die Kapillaren mit der Bindung Reaktionen und legen in die Kapillare Fach. Laden Sie das Fach in das Gerät, warten Sie, bis die Temperatur auf 25 ° C wieder und starten Sie die Messung. Datenanalyse Öffnen Sie die Bindung Assay-Datei in die Affinität-Analyse-Software. Überprüfen Sie die Kapillare Scans; Fluoreszenz-Ebenen sollte nicht mehr als 10 % vom Durchschnitt abweichen, keine Aggregation oder Adsorption sollte erkannt werden, wie im Abschnitt 3.6 beschrieben. Wählen Sie die MST-Analyse auf der rechten Seite und ziehen Sie die Test-Daten in die Analyse-Set. Es gibt mehrere Durchläufe des gleichen Ziel-Ligand verbindliche Tests unter identischen Bedingungen können sie durch Fallenlassen in den gleichen Satz zusammengeführt werden. Alternativ kann jeder Ausführung in Analyse unabhängig fallen gelassen werden. Wechseln Sie zur Registerkarte Dosis Antwort passen die Daten grafisch darstellen. Wählen Sie die K-D -Modell, wenn eine einzelne Bindungsstelle erwartet wird. Das Hill-Modell ist auch eine Option für mehrere Bindungsstellen mit kooperatives Verhalten. Ausreißer-Punkte, die Qualitätskontrolle nicht bestanden haben können in diesem Stadium die Passform entfernt. Merge-Sets mit mehreren Tests gemittelt werden und Fehler als die Standardabweichung berechnet. Öffnen Sie die letzte Registerkarte und vergleichen Sie die Ergebnisse zwischen allen Parzellen in einem einzigen Diagramm. Rufen Sie passende Ergebnisse für jede Kurve aus der Tabelle, die generiert wird. Auf Wunsch exportieren Sie die Daten oder angepasste Kurven zu anderen Präsentation oder Analyse-Software.