قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج وتنقية البروتينات المسماة بالنظائر، وتوصيف اللاحقة لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام مطيافية “الرنين المغناطيسي النووي” (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة تجارب ثيرموفوريسيس (MST).
Abstract
توفير البروتينات الخيطية مثل فيمنتين يكرر المنظمة داخل الخلايا بتوفير سقالة هيكلية مع المواقع التي تربط بين البروتينات التي تحتوي على بلكين. هنا، هو وصف بروتوكول لكشف وقياس هذه التفاعلات باستخدام المجال تكرار بلكين كروي من انفوبلاكين ولفائف حلزونية من فيمنتين. وهذا يوفر أساسا لتحديد ما إذا كان بروتين يربط فيمنتين (أو البروتينات الخيطية مماثلة) وقياس تقارب التفاعل. بروتين كروي للاهتمام هو المسمى مع 15ن ومعاير مع البروتين فيمنتين في الحل. ويكتسب طيف الرنين النووي المغناطيسي ثنائية الأبعاد للكشف عن التفاعلات بمراقبة التغييرات في شكل الذروة أو التحولات الكيميائية، وتوضيح آثار شروط الحل، بما في ذلك مستويات الملح، والتي تؤثر على هيكل رباعي فيمنتين. إذا كان بروتين المصالح تربط يجند الخيطية، هو كمياً التفاعل ملزم باستخدام البروتينات المنقاة MST. هذا النهج طريقة مباشرة لتحديد ما إذا كان بروتين لمصلحة تربط خيوط، وتقييم كيفية تأثير التعديلات، مثل الطفرات أو شروط الحل، على التفاعل.
Introduction
التفاعلات بين البروتينات السماح بتشكيل الأجهزة الجزيئية التي إنشاء النظام داخل الخلايا. التفاعلات الفردية غالباً ما تكون ضعيفة ولكن عادة ما تسهم في مجمعات متعددي يمكن أن التعاونية وتنظيمها بشكل حيوي. فحوصات الحساسة التي توفر القرار الذري والمعلومات الكمية عن هذه التفاعلات المعقدة ضرورية للاستدلال على آليات وتصميم التدخلات مثل جزيئات شبيهة بالمخدرات. مطيافية الرنين المغناطيسي النووي هو وسيلة فعالة للحصول على هذه المعلومات حول تفاعلات البروتين، ويستخدم أيضا لفحص سريع يغاندس بما في ذلك تلك التي تربط ضعيف1. ويمكن تصنيف الرنين المغناطيسي الأساليب المستخدمة في تلك التي هي مراقبة البروتين أو يجند مراقبة. ويستخدم هذه المخطوطة النهج السابق الذي يتم الحصول على طائفة من أحد نظائر مستقرة المسمى بروتين صغيرة نسبيا (عادة تحت كاتشين 20) ويجند غير مسمى هو معاير. وهذا يسمح بقايا المسمى تشارك في التفاعل ليتم تعيينها في حالات إيجابية. مرة النماذج المعقدة، هناك تغييرات في البيئات الكيميائية لبقايا المتفاعلة التي تعبر عن نفسها كالتغيرات في التحول الكيميائي والشكل إشاراتها الرنين المغناطيسي النووي. يرتبط مدى هذه التغيرات بدرجة مشاركة هذه المجموعات في التفاعل. ويمكن قياس الاضطرابات التحول الكيميائي (Csp) بمقارنة سلسلة من أطياف الرنين المغناطيسي من البروتين التي تم جمعها في غياب ووجود كميات متفاوتة من يجند. يغاندس أكبر أو التفاعلات المعقدة، يمكن قياس التغيير في شكل الذروة أو كثافة للاستدلال على التفاعلات.
التجربة 2D الأكثر شيوعاً المستخدمة للكشف عن التفاعلات يجند هو تجربة الارتباط (هسقك) الكم واحد 15N-هيتيرونوكلير2. وهذا يتطلب أن بروتين واحد موحد يكون المسمى مع 15ن، الذي يتحقق عادة بالإعراب لهم كإصدارات معلم تقارب الثقافات البكتيرية كولاي تزرع في 15ن إثراء وسائل الإعلام. الربط الواضح عندما يتم فرضه الأطياف هسقك التي تم جمعها أثناء المعايرة، الكشف عن التغييرات الذروة لمجموعة فرعية مخلفات تشارك في تشكيل معقدة. يمكن أن يحدث التفاعل في نظام الصرف السريع حيث طي إشارات الدولة الحرة ويجند المشبعة إلى أحد السكان بلغ الذروة. بدلاً من ذلك، في حالة بطء تبادل بين الدول، تراعي كل الإشارات مع التكاملات التي تمثل تلك المبالغ النسبية. بينما يمكن استخدام التحليل لينيشابي الرنين المغناطيسي لتقدير الصلات ملزمة في بعض الحالات، أساليب مثل MST أثبتت أيضا مريحة وتوفر المصادقة عبر تفاعلات حقيقية.
المثال المقدم من اثنين من البروتينات وجدت داخل desmosomes. أنهم التوسط الوصلات بين سطوح الخلايا وسيتوسكيليتون والتوسط متعددي التفاعلات بين آلات التصاق الخلايا وخيوط متوسطة الحفاظ على سلامة الجلد وأنسجة القلب وتحمل من القص القوات. يمكن أن تؤدي الأمراض عندما تجدان البروتينات ديسموسومال مثل ديسموبلاكين أو فيمنتين بالطفرات أو الأجسام المضادة، مما يؤدي إلى زعزعة الاستقرار من تقاطعات خلية خلية، وبالتالي تفاعلاتها من الأهمية البالغة3. يمكن وصف الأساس الهيكلي ليجند ملزم بالبروتينات ديسموسومال مطيافية الرنين المغناطيسي النووي، بينما يمكن قياسها كمياً التفاعلات التي MST. واستخدمت أساليب هنا لوصف التفاعلات بين المجالات بلكين تكرار (المكتب) التي غالباً ما تكون موجودة كمجموعات جنبا إلى جنب التي تقدم الأخاديد الأساسية، وفيمنتين، خيوط وسيطة التي تتفاعل من خلال سطح حمضية تقدمها لها حلزونية حزمة4. وتتشكل هذه المجمعات في غشاء الخلية حيث أنها مرساة خيوط متوسطة من سيتوسكيليتون الخلية إلى desmosomes التي تتصل بالخلايا المجاورة، مما يشكل شبكة سندات التصاق الذي يشع في جميع أنحاء أنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
2D 15تجربة حل ن الرنين المغناطيسي واحدة من الأكثر استخداماً أساليب لإظهار كيف اثنين من جزيئات تتفاعل. هو الأسلوب الأكثر الغنية بالمعلومات التي تتيح إشارات كل من الشركاء يتعين رصدها بشكل مستمر طوال تجربة معايرة في الدولة الحل. على الرغم من أن نوعية عادة في حالة المجمعات الكبيرة، الأسلوب يمكن أيضا استخدام في حالات إيجابية لقياس الانتماءات الملزمة حيث يمكن تتبع إشارات الرنين المغناطيسي النووي في الأطياف عالية الدقة. حيث يمكن إجراء تعيينات مريح، كما هو الحال في حالة العديد من البروتينات تحت كاتشين 20 في حجمها، ومواقع الربط يمكن أيضا تعيين. فحوصات تكميلية مثل MST توفير معلومات كمية عن التفاعلات في الحل، وتتطلب أقل من البروتين في الدول غير مسمى. مقارنة متحولة ربط البيانات مفيد في توفير الضوابط لضمان حقيقي يتجلى في الرنين المغناطيسي خط توسيع التفاعلات ولا التحف، على سبيل المثال، تغيير التجميع أو اللزوجة.
تعبير البروتين
تبسيط عملية التعبير يقلل كمية إنتاج البروتين كثيفة العمالة. ويشمل جزء من عملية التحسين هذه التعرف سلالة كولاي المناسبة للتعبير المؤتلف من البروتين. سلالة التفضيل يعتمد على العناصر بما في ذلك طبيعة الموجه في استخدام، وأكثر تحديداً، الاستقرار في نهاية المطاف للبروتين المؤتلف الذي أعرب عن7. الخطر تدهور البروتين مغايرة بالذاتية كولاي يمكن الحد من البروتياز باستخدام حوزتي ناقصة كولاي مثل سلالة BL21. للجينات التي تحتوي على codons النادرة، قد يكون سلالة مثل BL21-كودونبلوس (DE3) RIPL المفضل. هذه السلالة تجمع بين طبيعة حوزتي ناقصة من سلالة BL21 مع نسخ محلية إضافية من ترنس كودون نادرة ارجينين، آيسولوسين، برولين، ولوسين. وبدلاً من ذلك، قد تجنب codons النادرة التي يمكن أن تنال من أوفيريكسبريشن حسب ترتيب بناء كودون الأمثل من مصدر تجاري. تتوفر العديد من سلالات كولاي التعبير الجيني المؤتلف، كل الأمثل للتحايل على مشكلة خاصة أثناء التعبير7. في حالة هذه الدراسة، أنتجت سلالة ناقصة حوزتي القياسية BL21(DE3) كميات كافية من البروتين للذوبان لتنقية اللاحقة والتحليل.
تنقية البروتين
بروتوكول تنقية بروتين معين في كثير من الأحيان فريدة من نوعها بمعنى أن كل البروتين لا تزال مستقرة وقابلة للذوبان تحت ظروف مختلفة مثل درجة الحرارة، وتركيز الملح، أو الأس الهيدروجيني. الفعالية الشاملة لتنقية من خلال التقارب اللوني أيضا حساسة إلى تركيز الأنواع التينج مثل ايميدازول في الخطوات المختلفة أثناء عملية التنقية. في هذا العمل، وكانت ظروف حرجة المخزن المؤقت ايماك الأس الهيدروجيني لهاء-دلتا نهر اللؤلؤ، وتركيز ايميدازول فيمرود. وكان الرقم الهيدروجيني 7.5 المطلوبة لتجنب ترسيب ه-دلتا نهر اللؤلؤ بعد شطف الأولى من العمود ايماك. لتنقية ايماك فيمرود، عثر على زيادة تركيز ايميدازول من 30 إلى 50 ملم خلال الخطوة أغسل العمود إلى تحسن كبير في نقاء الكسور شطف النهائي. لخطوة شطف، زيادة تركيز ايميدازول من 250 إلى 350 مم كما وجد أن زيادة غلة شطف النهائي. المحاولات الأولى للبروتين باستخدام 250 ملم ايميدازول الوت أدت إلى شطف ناقصة من فيمرود كما كشف شريط ايميدازول م 1 نهائي من العمود (البيانات لا تظهر). زيادة تركيز ايميدازول إلى 350 ملم شطف كان كافياً لاستعادة كل من البروتين ملزمة للعمود. S يمكن أن تخدم غرضاً مزدوجاً لأنها بمثابة خطوة الصقل لتنقية البروتين أثناء أداء exchange المخزن المؤقت في وقت واحد. تبادل المخزن المؤقت خطوة حاسمة لتحليل ملزمة اللاحقة حيث أنه يزيل ايميدازول المستخدمة إلى الوت معلم His6 البروتين. أنها أيضا بمثابة فرصة لتغيير ظروف مثل تركيز الملح أو درجة الحموضة، مما قد يؤثر في فعالية تقنيات المصب أو فحوصات معينة. البروتين التحول الحراري (PTS) يمكن استخدامها لتحديد المخازن المؤقتة الأمثل لفحوصات المصب، خاصة بالنسبة لتلك التي تتطلب البروتين مستقرة لإطالة فترات زمنية في درجة حرارة الغرفة8،9.
تحليل ملزمة
البروتين الذي هو طازج أمر بالغ الأهمية لفحوصات دقيقة ملزمة، على الرغم من أن يمكن أيضا استخدام البروتين المجمدة طالما يتم مقارنة النتائج. البروتينات الخيطية مثل مولتيميريزي فيمنتين بطريقة تعتمد الملح والحموضة، ومن ثم الحل شرط الحاجة إلى أن يكون الأمثل والدولة oligomeric المقدرة باستخدام أسلوب مثل ثانية10،11، دينامية تناثر الضوء 12 أو التحليلية تنبيذ فائق13،،من1415. مطيافية الرنين المغناطيسي النووي أيضا مناسبة لقياس التفاعلات يجند البروتينات الصغيرة في القرار الذري. ومع ذلك، عند بروتين يتفاعل مع جزيء أكبر، وتستتبعه الهبوط أبطأ، وهذا يؤدي إلى فقدان الإشارات، التي يمكن أن تؤكد ملزم على الرغم من أنه لا بالضرورة السماح لرسم الخرائط لربط المواقع، مما سيتطلب أيضا انتداب على الأقل العمود الفقري الأصداء. في هذا السيناريو، لا تسمح تجارب الرنين المغناطيسي تعريف الموقع التفاعل. ومن ثم توجه الموقع الطفرات يتم تطبيق تحديد المخلفات الحيوية اللازمة للربط. ولذلك لا يحمل هذه طفرات فقدان إشارة. في هذا البروتوكول، يحتفظ بكثافة الذروة في وجود فيمرود نموذج متحولة مع استبدال في موقف عام 1914 ويؤكد ذلك اختلال تفاعل ه-دلتا نهر اللؤلؤ وفيمرود. تعيين الأصداء العمود الفقري و sidechain ستضيف قيمة إلى هذا النهج، لا سيما وأن هيكل ه الحرة–دلتا نهر اللؤلؤ قد حلت بعلم البلورات بالأشعة السينية4. التطبيقات المستقبلية للرنين المغناطيسي النووي تشمل توصيف للتفاعلات المعقدة بين الجزيئات أكبر وسوف تستفيد من المغناطيس الحقل عالية جداً، واستخدام جماعات أخرى يمكن ملاحظتها مثل 13ج المسمى ومجموعات الميثيل تريفلورو كالصحفيين.
MST يحتوي على عدد من المزايا لدراسة التفاعلات ملزمة16. الشركاء ملزمة حرة في الحل وليس المعطل تداولها. تحليل نوعية العينات هو في صلب البرنامج مع الإبلاغ عن مراقبة الجودة للتجميع، الامتزاز بالشعيرات الدموية أو وضع العلامات الفلورية غير كافية للجزيء المستهدف. يتم عادة استخدام كميات صغيرة من الهدف، وتركيز الهدف المسمى عادة ما بين 20-50 نانومتر في 10-20 ميكروليتر حجم/رد فعل. هذا البروتوكول يستخدم كميات صغيرة جداً من رد فعل (10 ميكروليتر) لتحقيق أقصى التركيز ليجند التي يمكن تحقيقها في المعايرة السماح للتفاعلات ملزمة ضعيفة تتسم. وهذا يستدعي بيبيتينج والحرص على تجنب إدخال فقاعات بينما لا يزال دقة خلط دقيقة. خلط الكافية أمر بالغ الأهمية للقياسات fluorescence دقيقة ومتسقة على طول مجموعة تخفيف المسلسل. تم تخفيض مبلغ 20 توين في التجارب MST من معيار 0.05% إلى 0.015% إلى انخفاض الميل إلى خلق فقاعات وتحسين الاختلاط.
الصبغ الأحمر-تريس-جاتا يوفر طريقة سريعة وسهلة ومريحة لتسمية أي البروتين الذي يحتوي بلده فلوريسسينتلي العلامة. العلامات فعالية كاملة في 30 دقيقة فقط، وهو ضيق جداً بحيث لا إجراء إزالة الصبغة ضروري. يتم إجراء لا تعديلات مخلفات الأحماض الأمينية في البروتين الذي قد يغير خصائص ملزم يجند. تحذير أن يكون فقط البروتين يكون المسمى علامة His6. وهذا يتطلب الانقسام والعلامة من البروتين يجند، ﻫ-دلتا نهر اللؤلؤ، وإزالة العلامة وه أونكليفيد–دلتا نهر اللؤلؤ مع خطوة ايماك عمود ثاني. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي إعداد البروتين يجند دون استخدام له علامة. بدلاً من ذلك، قد يكون المسمى البروتينات تساهمي مع فلوروفوري من خلال اقتران لبقايا يسين أو ثيول اقتران لبقايا السيستين أمين. ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند استخدام هذه النظم منذ إلحاق fluorophore التساهمية قد تؤثر على التفاعلات الربط الكهربائي أو القطبية تعتمد على بقايا يسين أو سيستين. وكان التحديد الكمي لملزمة تقارب بين فيمرود وهاء-دلتا نهر اللؤلؤ من MST الحساسة غير عادي للملح تركيز. كان التخفيف من هذه المشكلة بالبداية دياليزينج كل من الهدف ويجند في نفس الدفعة من المخزن المؤقت للمقايسة. ومع ذلك، لا يمكن تحقيق التشبع المنحنى ملزمة MST عند إجراء المقايسة MST حضور 150 مم كلوريد الصوديوم بسبب سلوك معقدة من فيمرود. تم الحصول على بيانات موثوق بها وكاملة بمجرد خفض تركيز كلوريد الصوديوم إلى 10 ملم يسمح حساب دقيق من كد. ومن ثم، ينصح الأمثل دقيق لشروط الحل والمقارنة مع فحوصات مكملة لتحقيق نتائج قوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام MST التحديد الكمي للاعتماد على الملح لوجود تفاعل معين، وتحديد خصائص المقايسة لتفاعلات البروتين، ورصد طي البروتين، والتحقيق في حركية إنزيم17.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المشروع قد حظي بمقدمة رجبين-2018-04994، برنامج الابتكار ألبرتا للحرم الجامعي (ج RCP-12-002) ومعهد بحوث بريون ألبرتا/”ألبرتا يبتكر الحلول الحيوية” (201600018)، منح M.O والجينوم كندا و “المؤسسة الكندية” ل الابتكار المنح المقدمة إلى مركز الابتكار جميع (تميك) ونانوك.
Materials
| Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
| His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
| Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
| HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
| HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
| TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
| BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
| TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
| Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
| Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
| D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
| DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
| Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
| NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
| TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
| MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
| MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |
References
- Vinogradova, O., Qin, J. NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions. Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).
- McKercher, M. A., Wuttke, D. S. NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions. Methods in Molecular Biology. 1555, 269-290 (2017).
- Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases. Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).
- Fogl, C., et al. Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin. Nature Communications. 7, (2016).
- Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , (2002).
- Wishart, D. S., et al. 1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR. J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).
- Casali, N. Escherichia coli Host Strains. E. coli Plasmid Vectors. , 27-48 (2003).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- Kozak, S., et al. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).
- Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. , (2018).
- Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).
- Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
- Pearson, J. Z., Cole, J. L., et al. Chapter One – Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. Methods in Enzymology. 562, 1-26 (2015).
- Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B., Cole, J. L. Chapter Two – Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. Methods in Enzymology. 562, 27-47 (2015).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, 100 (2010).
- Jerabek-Willemsen, M., et al. MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).
