Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

1. recombinant eiwit expressie Uitdrukking van Envoplakin PRD (E-PRD) en Vimentin 99-249 (VimRod) Tover E. coli BL21(DE3) cellen met de plasmide met het gewenste gen. Verspreid de cellen op agar platen met 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de platen bij 37 ° C’s nachts. Kies een één kolonie en geweldig Bouillon (TB) 20 mL met 100 µg/mL ampicilline te selecteren voor het plasmide beënten. Het groeien van de cultuur bij 37 ° C met schudden (180 rpm) ‘s nachts. De hele 20 mL cultuur overbrengen in 1 L van TB met 50 µg Mo/mL ampicilline. Incubeer de cultuur bij 37 ° C met schudden bij 180 t/min tot de OD600 = 0,6-0,8. Verlaag de temperatuur tot 18 ° C en eiwit expressie veroorzaken door isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe te voegen aan een eindconcentratie van 1 mM. Incubatie op 18 ° C met schudden bij 160 rpm’s nachts eiwit expressie mogelijk te blijven. Oogst van de cellen door centrifugeren van de cultuur bij 8.000 x g gedurende 15 min. Decant en verwijder het supernatant. Wassen de geoogste cellen door het resuspending van de cel pellet in ongeveer 40 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 20 mM fosfaatbuffer, pH 7.4, 120 mM NaCl). De resuspensie overbrengen in een tube van 50 mL. Centrifuge weer bij 8.000 x g gedurende 15 minuten. Decanteren en verwijder het supernatant. Onmiddellijk beginnen met het protocol van de zuivering of de cel pellets bij-20 ° C voor toekomstig gebruik te bevriezen. Expressie ionenpaar gelabelde eiwit Transformeren van E. coli BL21(DE3) cellen en bereiden een 20 mL starter cultuur zoals in 1.1.1-1.1.2. De hele 20 mL cultuur overbrengen in 1 L van verrijkte TB met een extra 4.0 g trypton, 5,0 g NaCl en 100 µg/mL ampicilline. Incubeer de cultuur bij 37 ° C met schudden bij 160 rpm tot de OD600 = 1.6-1.9. Oogst de 1 L cultuur door middel van centrifugeren bij 8000 x g gedurende 15 min. Decant en verwijder het supernatant. Wassen van de cel pellet door zachtjes resuspending in ongeveer 40 mL PBS en de resuspensie overbrengen in een tube van 50 mL. Centrifugeer nogmaals bij 8.000 x g gedurende 15 min. Decant en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 20 mL van de M9 minimale media (tabel 1) en transfer naar de rest van de 950 mL van minimale media M9 met 100 µg/mL ampicilline. Voeg 50 mL van de nutriënten mix filter gesteriliseerde (tabellen 2 en 3). De cultuur tot 18 ° C gedurende 30 minuten acclimatiseren voordat u IPTG toevoegt aan een eindconcentratie van 1 mM. Na een nacht bebroeden bij 18 ° C met schudden bij 160 t/min. Het oogsten van de cellen in de sectie 1.1.4-1.1.6. 2. geïmmobiliseerd Metal Affinity chromatografie (IMAC) zuivering van VimRod en E-PRD Zuivering van His6-gelabeld VimRod Resuspendeer de pellet cel in 5 mL/g van PBS met een protease inhibitor cocktail ontbreekt EDTA. Meng met 12 lijnen in een Dounce weefsel homogenizer ter verbetering van de lysis van de cel in de volgende stap. Op het ijs, bewerk ultrasone trillingen ten de celsuspensie op een puls van 1 s op/1 s uit, 80% amplitude voor een totaal van 1,5 min. herhaalt het ultrasoonapparaat twee meer tijden, wervelende zachtjes op ijs tussen runs om oververhitting te voorkomen. Centrifugeer het monster bij 75.000 x g gedurende 45 min. Decant en filteren van het supernatans dat met behulp van een injectiespuit filter (0,45 µm). Equilibreer een 5 mL IMAC-kolom met 5 kolom volumes (CV) van bindende buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol) op een debiet van 1 mL/min met behulp van een systeem van snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC). Het laden van het gefilterde supernatant op de kolom op een debiet van 0,5 mL/min. Was de kolom met 5 CV van wassen buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 50 mM imidazol) met een debiet van 1 mL/min. Elueer de proteïne met 3 CV van elutie buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 350 mM imidazol) op een debiet van 0,5 mL/min. verzamelen 1,5 mL breuken. Indien beschikbaar, selecteer de up-flow elutie-modus te verhogen de concentratie eiwit geëlueerd. Het identificeren van de breuken van het chromatogram FPLC die bevatten de proteïne van belang door SDS-PAGE en standaardmethoden voor het meten van de concentratie eiwit5gebruiken. Bundelen en het concentreren van de elutie breuken met de hoogste hoeveelheid eiwit een centrifugaal ultrafiltratie-apparaat (MWCO 3 kDa, 5 mL) tot 2 mL gebruikt. Centrifugeer bij 21.000 x g te verwijderen van een eventueel neerslag en passeren een 0,22 μm-filter. Equilibreer een uitsluiting voor 120 mL grootte met de kolom-chromatografie (S) met 2 CV van S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0.5 mM TCEP) op een debiet van 1 mL/min met behulp van een FPLC. Injecteer de geconcentreerde eiwit uit 2.1.9 op de kolom en elueer met 1 CV van S buffer op een debiet van 0,5 mL/min, verzamelen van 1 mL breuken. Het identificeren van de breuken met de proteïne van belang als vóór. Het zwembad van de fracties die de hoogste hoeveelheden eiwitten bevatten. Bewaren bij 4 ° C voor korte termijn gebruik of glycerol toevoegen aan 20% en winkel bij-80 ° C in kleine porties. Zuivering van E-PRD eiwit met de His6 Tag verwijderd Volg de stappen in de 2.1.1-2.1.8 voor het zuiveren van His6-gelabeld E-PRD eiwit. Bundelen van de piek fracties en bepalen de eiwitconcentratie. Toevoegen van tabak etch virus (TEV) protease (1 mg/mL) 2 µL/mg van gebundelde eiwit. Overbrengen van dialyse buizen (6 kDa) en dialyze in S buffer’s nachts bij 4 ° C. Deze stap kunt splitsing van de His6-tag en verwijdering van de imidazool die met de binding aan de Ni-NTA hars in de volgende stap interfereren zal. Equilibreer 5 mL Ni-NTA hars in een gravity kolom met 3 CV van S buffer. Afvoer overtollige buffer van de hars. Giet het gekloofd E-PRD-eiwit op de hars en incubeer gedurende 1 uur op een rockende platform de uncleaved His6-gelabeld E-PRD en de gekloofd His6 tag te binden. De TEV protease is ook His6-gelabeld en zal binden de hars. Verzamel de stroom door, waarin de tag-vrije E-PRD. Wassen van de hars met 2 CV van S buffer om ervoor te zorgen dat alle van de E-PRD wordt teruggewonnen. E-PRD concentreren in de stroom door tot 2 mL met behulp van een apparaat van de centrifugaal ultrafiltratie (MWCO 3 kDa, 5 mL). Centrifugeer bij 21 000 x g te verwijderen van een eventueel neerslag en passeren een 0,22 μm-filter. Equilibreer een 120 mL S-kolom met 2 CV van S buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0.5 mM TCEP voor MST of 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 voor NMR) op een debiet van 1 mL/min met behulp van een FPLC. Injecteer de geconcentreerde E-PRD-eiwit uit 2.2.5 op de kolom en elueer met 1 CV van S buffer op een debiet van 0,5 mL/min, verzamelen van 1 mL breuken. Het identificeren van de breuken met de proteïne van belang als vóór. Het zwembad van de fracties die de hoogste hoeveelheden eiwitten bevatten. Bewaren bij 4 ° C voor korte termijn gebruik of glycerol toevoegen aan 20% en winkel bij-80 ° C in kleine porties. 3. NMR methoden NMR monstervoorbereiding Zuiveren van 15N-geëtiketteerden wild-type of R1914E E-PRD eiwitten zoals eerder is beschreven met behulp van 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 als de S-buffer voor stap 2.2.6. Eiwit stamoplossingen variëren meestal van 0,3 tot 1 mM met volumes van ongeveer 1 mL.Opmerking: Eiwit kan worden geconcentreerd > 100 µM met behulp van een MWCO 3 kDa, 5 mL centrifugaal ultrafiltratie apparaat om de concentratie in een geschikt bereik voor de bereiding van de monsters. Zuiveren van een steekproef van labelloze VimRod eiwit met 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 als de S-buffer voor stap 2.1.10. In een eindvolume van 500 µL, wild-type of mutant E-PRD eiwit toevoegen om een eindconcentratie van 100µM, deuteriumoxide (D2van O) om een eindconcentratie van 10% (v/v) en DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic zuur) tot een uiteindelijke concentratie van 20 µM. Bring Het monstervolume tot 500 µL met behulp van 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. De voorbereiding van een representatieve steekproef wordt beschreven in tabel 4.Opmerking: De 0 ppm resonantie van DSS wordt gebruikt voor het kalibreren van de chemische shifts van 1H, alsmede voor indirecte référencement van de 15N chemische verschuivingen van de eiwit-6. D2O wordt gebruikt voor het deuterium lock signaal om te houden van de spectrometer die op een constante netto magnetisch veld. Make-up een tweede monster van E-PRD, D2O en DSS zoals in de vorige stap en voeg VimRod aan een eindconcentratie van 50 µM alvorens het volume tot 500 µL. De 500 µL monsters overbrengen in een 5 mm breed-NMR buizen voor het experiment. NMR experimentele opstelling Inschakelen van de luchtstroom met de eject opdracht “ej”; Dit zal het monster van de magneet. Nu, leg het monster binnen een spinner op de top van de magneet door de opening en invoegen met de opdracht “ij”. Wacht totdat het monster afwikkelt binnen de magneet voordat u verdergaat. Maak een nieuwe dataset met behulp van de opdracht “edc” en laden norm 1H NMR parameters door het selecteren van experiment “ZGPR” (Figuur 1). De naam, de EXPNO (experiment nummer) en de PROCNO (verwerkte gegevens mapnummer) velden invullen. Selecteer het oplosmiddel in het veld “Set oplosmiddel” en klik op “Uitvoeren ‘getprosol'” om te lezen van de standaard probehead en oplosmiddelen afhankelijke (prosol) parameters. Het monster, tot de Halfzwaar solvabel is, dat wil zeggen, D2O vergrendelen, opdracht “vergrendelen” en wacht totdat het is voltooid vegen en behaalt vergrendelen. De resonantiefrequentie van de magneet corrigeren door het monster met behulp van de automatische tuning opdracht “atma” tuning. Volgen de wobble curve totdat de automatische afstemming voltooid is. Shim het magnetisch veld met behulp van TOPSHIM (opdracht “topshim”). Shimming is een proces van aanpassingen van magnetisch veld om uniformiteit rond het monster. Het is raadzaam de shim-waarden met de opdracht “wsh” opslaan en lezen van hen gebruikend “rsh” voor topshim, als het dezelfde of soortgelijke monsters. Pas de receiver gain met “rga” commando om het maximale signaal / ruisverhouding. Plaats het midden van het spectrum op de verschuiving van de resonantie water (o1) en stel de 90 graden proton pols (p1) op hoog vermogen met behulp van de “calibo1p1”. Verzamel de proton-spectrum met behulp van de nul gaan “zg” commando en proces met “efp” inclusief exponentiële vermenigvuldiging (“em”), het gratis inductie verval (FID) houdende uitbreiding van de lijn “ft” fourier transformatie van de FID en “pk” toe te passen fase correctie. De automatische fase correctie “apk” en de correctie van de basislijn van automatische “absn” met behulp van de polynoom zonder integratie optie toepassen. Maak een nieuwe dataset (zoals in 3.2.2) voor het SOFAST HMBC experiment door het selecteren van “SFHMQC3GPPH” in de experiment. Kopie geoptimaliseerd P1 en O1 van proton spectrum en vullen van P1 afhankelijke pulsen met behulp van de opdracht “getprosol 1H p1 plw1”, waar p1 is de geoptimaliseerde waarde P1 en plw1 is het energieniveau voor P1. Optimaliseren van de constante CNST54 als u wilt instellen van de verschuiving voor amide chemische verschuiving en CNST55 om te bepalen de bandbreedte omvatten de spectrale regio’s van belang waardoor de winst van de ontvanger te worden geoptimaliseerd (Figuur 2). Schakel deze parameters, de eerste FID (free induction decay) uittreksel uit het twee-dimensionale spectrum en zoekt het waargenomen signaal ze kunnen worden gedefinieerd. Bovendien variëren de ontspanning vertraging (D1), aantal scans (NS), en dummy scans (DS) te verkrijgen van acceptabel signaal gevoeligheid met opdracht “gs”, die kunnen gaan en scannen om te controleren de kwaliteit van de gegevens in real-time. Het opnemen van de spectra met nul Go “zg”. Verwerking van de gegevens van de NMR De verwerkingsparameters instelt op het formaat van de directe F2 (1H) en indirecte F1 (15N) afmetingen van het gebruik van het spectrum “SI F2 = 2048, F1 = 512” met optionele lineaire voorspelling in indirecte dimensie (Figuur 3). Selecteer “QSINE” als de functie van het venster en voer een sinus bell verschuiving (SSB) van 2 voor het verwerken van de tweedimensionale spectrum. Voer de opdracht “xfb” om de gegevens in beide richtingen met venster functie en de fourier transformatie te verwerken. Gebruik de opdracht “apk2d” voor het uitvoeren van de automatisch fasecorrectie in beide richtingen. Als het automatische proces niet een bevredigend niveau van fasecorrectie tot, FID’s uitpakken met het commando “rser” fase waarden van 1D verwerking berekenen en toepassen op de 2D gegevens. Corrigeer de basislijn met de automatische basislijn-correctiefunctie “abs2” voor 2D gegevens. Dit geldt een polynomiale functie tussen de ppm waarden omschreven in de verwerkingsparameters en zal produceren een 2D spectrum voor verdere analyse. Als het plan voor het uitvoeren van seriële verwerking voor vergelijking van gegevens van de interactie met een ander molecuul, slaan de verwerkingsparameters met de opdracht “wpar” en herinneren ze met “rpar”. Op deze manier die alle de datasets worden verwerkt met dezelfde parameters en variaties zullen niet worden ingevoerd als gevolg van verwerking van verschillen. NMR Data-analyse Voer de opdracht “pp” om te beginnen met het proces van het plukken van de piek. Definieer de ppm bereik en minimum intensiteit/maximaal aantal pieken gebaseerd op verwachte pieken (Figuur 4). Klik op OK en bevestig de resultaten door visuele inspectie. Indien nodig, opnieuw uitvoeren het proces totdat de resultaten bevredigend zijn gebaseerd op spectra-kwaliteit. Het genereren van een peaklist met het commando “pp”.Opmerking: Deze peaklist bevat gegevens hoogte/piek intensiteit informatie standaard en kan worden geëxporteerd naar latere Spectra en kan worden gelezen door andere programma’s. Houd rekening met wijzigingen in de piek intensiteit of beweging in chemische shifts in het eiwit HSQC spectra die interactie met een ander molecuul aangeven. Als de interactie molecule groot is, verwachten reducties in piek intensiteit samen met de verdwijning van sommige toppen. De piek-lijst naar de volgende gegevensset importeren door te klikken op het tabblad “pieken” en “importeren” met een klik met de rechtermuisknop in het venster van de pieken. Visualiseren van de pieken in het spectrum en indien nodig ze te verschuiven naar een nieuwe positie. Klik op “reset intensiteiten” voor “complete table” voor het genereren van een peaklist voor het spectrum met intensiteiten (Figuur 5). Deze piek-lijst zal over de positiegegevens van opgeslagen piek lijst dragen. De piek-lijsten uit verschillende datasets exporteren naar een werkblad of een ander wiskundig programma voor analyse door de “Export”-functie te selecteren. Bereken de verandering in de piek intensiteit met de functie “piek intensiteit in complexe spectrum/piek intensiteit in eiwit spectrum” voor elke piek. Waarden kunnen worden geconverteerd naar procentuele verandering door vermenigvuldiging van 100. Merk op dat piekvolumes ook nuttig, zijn hoewel de piek intensiteit zijn gemakkelijker te meten voor bergtoppen die dicht bij elkaar liggen, zoals meestal het geval voor eiwitten met een hoge varkensdichtheid relatief brede pieken. 4. MicroScale Thermophoresis (MST) Voorbereiding van de Ligand eiwit E-PRD Wisselen de ligand in een MST compatibel buffer door dialyzing tot 800 μL van eiwit in een 3,5 kDa mini dialyse eenheid geschorst in 1 L van 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, roeren langzaam bij 4 ° C’s nachts. Concentreren de ligand met behulp van een centrifugaal ultrafiltratie eenheid (3 kDa MWCO) door centrifugatie bij 14 000 x g gedurende 10 min. overdracht de geconcentreerde eiwit tot een schone koker. Centrifugeer het ligand bij 21.000 x g gedurende 10 minuten en het supernatant zorgvuldig overbrengen in een nieuwe buis te verwijderen elke neergeslagen eiwitten. Bepaal de concentratie van het ligand met behulp van de extinctie op 280 nm en de ligand uitsterven coëfficiënt. Voeg 10% Tween-20 te geven een eindconcentratie van 0,015%. Tween-20 is toegevoegd aan de buffer assay ter voorkoming van adsorptie aan de haarvaten. De definitieve test buffer die wordt gebruikt voor de MST experimenten is 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0,015% Tween-20. Bereiding van de kleurstof-geëtiketteerden Target eiwit VimRod Het reconstrueren van de rood-tris-NTA kleurstof door toevoeging van 50 μl van 1 x PBS-T is voorzien van de rood-tris-NTA tot een concentratie van 5 μM. 2 μL aliquots afzien in 200 μl buizen en opgeslagen bij-20 ° C. Verdun de eiwitten van de doelgroep naar 0,34 μM met assay buffer. 58 μL van doel toevoegen aan een hoeveelheid van 2 μL van RED-tris-NTA kleurstof en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De uiteindelijke concentratie van kleurstof-geëtiketteerden doel is 0,33 μM. Centrifugeer de gelabelde doelgroep op 21.000 x g gedurende 10 minuten en het supernatant zorgvuldig overbrengen in een nieuwe buis te verwijderen van een eventueel neerslag. De RED-tris-NTA kleurstof bindt aan eiwitten door middel van het His6-label en heeft een bindende dissociatieconstante (KD) in het bereik van de sub-nanomolar. Het is in feite 100% gebonden aan het doel-eiwit dus geen verdere zuivering vereist is. Zet het MST-instrument en de controle-Software niet openen. Selecteer de rode instelling voor de rood-tris-NTA kleurstof. Zet de thermostaat op 25 ° C. Selecteer het dit om te valideren dat de etikettering van het doel en controleer voor aggregatie of adsorptie aan de cuvettes. Een evaluatie van deze parameters wordt automatisch verstrekt. Mix-17 μL van assay buffer en 3 μL van doel eiwit en meng door pipetteren. Vul twee standaard haarvaten door dompelen hen in het verdunde doel en het opstellen van vloeistof in het midden van het capillair. Plaats de haarvaten in de lade en de instrumenten. Start de meting. Bekijk de resultaten op zoek naar een voldoende niveau van fluorescentie en geen tekenen van adsorptie (vervorming in de shape capillaire lijn) of aggregatie (verstoringen in de MST trace), die zal worden gemarkeerd in de analyse van de software. Indien resultaten positief zijn op de ligand stappen, zo niet een andere buffer moet worden geprobeerd of het bedrag van de Tween-20 kan worden verhoogd tot 0.05% of hoger. Voorbereiding van de E-PRD Ligand tweevoudige verdunningsreeks Bereiden van een verdunningsreeks door labeling 16, 200 μl buizen van 1-16. 17 μL van de ligand op 1.17 x sterkere concentratie dan de concentratie van de maximale ligand Tube1 wilde toevoegen. Dit volume is tweemaal het bedrag dat nodig is (8,5 μl) een aliquoot gedeelte wordt vervolgens overgebracht naar de volgende buis in serie. Het uiteindelijke volume van de bepaling is 10 μL dus 8,5 μl van 1,17 x concentratie van ligand zullen worden verdund tot 1 x door toevoeging van 1,5 μL van de doel-eiwit, VimRod. Deze maximale concentratie gekozen moet minstens 20 maal de geraamde KD waarde. De 8,5 μl van assay buffer aan Tubes2-16 met behulp van een nieuwe Pipet tip voor elk aliquot toevoegen. Hergebruik van Pipetteer tips kan invloed hebben op de nauwkeurigheid (voor advies over nauwkeurige pipetting zie aanwijzingen van de fabrikant). Breng 8,5 μl van ligand van Tube1 naar Tube2 langzaam het vrijgeven van de oplossing in de buffer assay zonder bubbels. Meng de ligand en de buffer door pipetteren omhoog en omlaag minstens 6 maal, weer zonder bubbels. De E-PRD in de meest geconcentreerde buis was 1,5 mM en de gelabelde VimRod was aanwezig bij een eindconcentratie van 50 nM. 8,5 μl van ligand overzetten van Tube2 naar Tube3 en meng met de assay-buffer. Herhaal de seriële verdunning totdat alle buizen ligand toegevoegd hebben. Gooi 8,5 μl van Tube16 zodat alle buizen 8,5 μl van ligand in een reeks tweevoudige verdunningen bevatten. Voorbereiding van het experiment bindend reactie en MST 1.5 μL van de gelabelde doel eiwit toevoegen aan elk van de buizen en meng zachtjes door pipetteren op en neer voorzichtig om te voorkomen dat de bubbels. Incubeer gedurende 15 minuten. Selecteer de Expert modus voor de bindende assay en voer in de parameters voor een seriële verdunningsreeks. Zorg ervoor dat de temperatuurregeling wordt ingesteld tot 25 ° C, de excitatie-kracht op 40%, en de MST-bevoegdheid op gemiddeld is ingesteld. Deze parameters moeten worden geoptimaliseerd voor andere partners van de bindende bestudeerd. Vul de haarvaten met de bindende reacties en plaats in de capillaire lade. De lade te laden in het instrument, wachten op de temperatuur om te herwinnen van 25 ° C en start de meting. Data-analyse Open het bindende assay-bestand in de software van de analyse van de affiniteit. Bekijk de capillaire scans; Fluorescentie niveaus niet meer dan 10% van het gemiddelde afwijken, geen samenvoeging of adsorptie moet worden gedetecteerd als beschreven in punt 3.6. Selecteer de MST analysis op het juiste paneel en sleep de assay-gegevens naar het analyse-apparaat. Als er meerdere punten van de dezelfde doel-ligand bindende bepaling onder identieke omstandigheden kunnen ze worden samengevoegd door slepen en neerzetten in dezelfde set. U kunt ook kan elke run wegvallen in analyse onafhankelijk. Verplaatsen naar het tabblad dosis reactie passen naar de grafiek van de gegevens. Kies het model KD als een enkele bindende site wordt verwacht. Het Hill model is ook een optie voor meerdere bandplaatsen met coöperatief gedrag. Uitschieter punten die niet is geslaagd voor kwaliteitscontrole kunnen worden verwijderd uit de pasvorm in dit stadium. Samenvoegen sets met meerdere tests zal worden gemiddeld en fouten berekend als de standaardafwijking. Open de laatste tabblad en vergelijken van resultaten tussen alle percelen op een enkele grafiek. Montage resultaten voor elke kromme opgehaald uit de tabel die wordt gegenereerd. De gegevens of exporteren ingerichte bochten naar andere presentatie of analyse software indien gewenst.