核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

1. 組換え蛋白質の表現 Envoplakin PRD (E-PRD) およびビメンチン 99年-249 (VimRod) の発現 目的遺伝子を含むプラスミドを持つ大腸菌BL21(DE3) セルを変換します。100 μ g/mL アンピシリンを含む寒天培地プレート上のセルを広めます。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。 単一コロニーをピックアップし、プラスミッドの選択 100 μ g/mL アンピシリンを含む素晴らしいスープ (TB) の 20 mL を接種します。(180 rpm) を一晩中揺れを 37 ° C で文化を育てます。 全体 20 mL 文化を 50 μ G/ml のアンピシリンを含む TB の 1 L に転送します。外径 φ600まで 180 rpm で振とうしながら 37 ° C で文化をインキュベート = 0.6 0.8。 18 ° C に温度を減らし、最終濃度 1 mM にイソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加することでタンパク質の発現を誘導します。蛋白質の表現を許可する一晩 160 rpm で振とうしながら 18 ° C で潜伏を続けてください。 8,000 の x g で 15 分間デカントで文化を遠心分離によって細胞を収穫し、上澄みを廃棄します。 リン酸塩の約 40 mL の細胞ペレットを再で収穫された細胞緩衝食塩洗浄 (PBS: 20 mM リン酸緩衝、pH 7.4 では、120 mM の NaCl)。再懸濁を 50 mL チューブに転送します。8,000 の x g で再度遠心して、15 分間。 デカントし、上澄みを廃棄します。すぐに浄化のプロトコルを開始または将来使用するための-20 ° C で細胞ペレットを凍結します。 同位体分類された蛋白質の発現 大腸菌由来BL21(DE3) 細胞を変形し、1.1.1-1.1.2 のように 20 mL スターター文化を準備します。 全体 20 mL 文化を追加 4.0 g トリプトン 5.0 g、塩化ナトリウム、100 μ g/mL アンピシリンを含む豊かな TB の 1 L に転送します。外径 φ600まで 160 rpm で振とうしながら 37 ° C で文化をインキュベート 1.6 1.9 を =。 15 分デカント 8000 × g で遠心分離によって 1 L 文化を収穫し、上澄みを廃棄します。 約 40 mL の PBS で優しく再細胞ペレットを洗浄し、再懸濁を 50 mL チューブに転送します。 再び 15 分デカントの 8,000 の x g で遠心し、上澄みを廃棄します。 M9 最小媒体を (表 1) と 100 μ g/mL アンピシリンを含む M9 最小媒体の 950 mL の残りの部分への転送の 20 mL の細胞ペレットを再懸濁します。 フィルター滅菌栄養組合せ (表 2 および 3) の 50 mL を追加します。 最終濃度 1 mM の IPTG を追加する前に 18 ° C、30 分に文化を慣らします。 160 rpm で振とうしながら 18 ° C で一晩インキュベートします。 セクション 1.1.4-1.1.6 のように細胞を収穫します。 2. VimRod と E PRD の金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) 精製を固定化 タグ付きの His6 VimRod の精製 プロテアーゼ阻害剤カクテル欠けている EDTA を含む PBS の 5 mL/ト細胞ペレットを再懸濁します。次の手順でセル換散を改善するために Dounce 組織ホモジナイザの 12 ストロークで均質します。 氷の上を 1/1 の s のパルスで細胞懸濁液を超音波、1.5 分の合計の 80% 振幅超音波処理追加 2 回、過熱を防ぐために実行の間氷の上ゆっくり旋回を繰り返します。 75,000 x g で 45 分間デカントでサンプルを遠心し、シリンジ フィルター (0.45 μ m) を使用して上清をフィルターします。 タンパク質の高速液体クロマトグラフィー (FPLC) システムを使用して 1 mL/分の流量で結合バッファー (20 mM HEPES、pH 7.5、500 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール) の 5 列ボリューム (CV) と 5 mL の IMAC のコラムを平衡させ。 0.5 mL/min の流速で列にフィルター処理された上澄みをロードします。 5 CV の洗浄バッファー (20 mM HEPES、pH 7.5、500 mM の NaCl、50 mM のイミダゾール) 1 mL/min の流速で洗い流します。 3 タンパク質を溶出溶出バッファー (20 mM HEPES、pH 7.5、500 mM の NaCl、350 mM のイミダゾール) 0.5 mL/分収集 1.5 mL の一部分の流量での CV。可能な場合、溶出蛋白質の濃度を増加する最大フロー溶出モードを選択します。 SDS-PAGE によって興味の蛋白質を含み、タンパク質濃度5を測定する標準的な方法を使用して FPLC クロマト グラムから分数を識別します。 プール、2 mL を遠心限外濾過装置 (MWCO 3 kDa、5 mL) を使用して蛋白質の最高額を含む溶出画分を集中します。任意の沈殿物を削除し、0.22 μ m フィルターを通過する 21,000 × g で遠心分離機します。 2 S CV バッファー (20 mM HEPES、150 mM の NaCl、pH 7.5、0.5 mM TCEP)、FPLC を使用して 1 mL/分の流量で 120 mL サイズ排除クロマトグラフィー (S) コラムを平衡させ。 列に 2.1.9 から高濃度のタンパク質を注入し、流量を 0.5 mL/min、1 mL の一部分を収集で 1 S CV バッファーで溶出します。 前に、として興味の蛋白質を含有する画分を識別します。 最高の量のタンパク質を含有する画分をプールします。 短期的使用のための 4 ° C で保存または 20% と小さい因数で-80 ° C で保存場所にグリセリンを追加します。 削除 His6 タグで E PRD タンパク質の精製 2.1.1-2.1.8 His6 タグ E PRD 蛋白質を浄化するための手順に従います。ピーク画分をプール、タンパク質濃度を決定します。 タバコを追加でプールされた蛋白質の 2 μ L/mg のウイルス (TEV) プロテアーゼ (1 mg/mL) をエッチングします。透析の管 (6 kDa) に移し、4 ° C で一晩 S バッファー内 dialyzeこの手順では、His6 タグの胸の谷間と、次のステップで Ni NTA 樹脂へのバインドに干渉イミダゾールの除去をことができます。 3 S CV バッファーを持つ重力列で Ni NTA 樹脂 5 mL を平衡します。樹脂から余分なバッファーをドレインします。 樹脂に劈開 E PRD タンパク質を注ぎ、分解されていないタグ付きの His6 の E-PRD と劈開の His6 タグをバインドするを許可するロッキング プラットフォームで 1 時間インキュベートします。TEV のプロテアーゼは His6 タグはまた、樹脂をバインドします。タグ無料 E-PRD を含む、流れを収集します。E PRD のすべてを確保するため洗浄 2 S CV バッファーで樹脂を回収します。 遠心限外濾過装置 (MWCO 3 kDa、5 mL) を使用して 2 mL に流れの E-PRD を集中します。任意の沈殿物を削除し、0.22 μ m フィルターを通過する 21000 × g で遠心分離機します。 2 S CV バッファー (20 mM HEPES、150 mM の NaCl、pH 7.5、0.5 mM TCEP MST または 20 mM トリス-HCl、1 mM DTT、NMR 用 pH 7)、FPLC を使用して 1 mL/分の流量での 120 mL S 列を平衡します。 列に 2.2.5 から集中 E PRD タンパク質を注入し、0.5 mL/min、1 mL の一部分を収集の流量で 1 S CV バッファーで溶出します。 前に、として興味の蛋白質を含有する画分を識別します。 最高の量のタンパク質を含有する画分をプールします。 短期的使用のための 4 ° C で保存または 20% と小さい因数で-80 ° C で保存場所にグリセリンを追加します。 3. NMR 法 NMR サンプル準備 15N 標識野生型または 20 ミリメートル トリス-HCl、1 mM DTT、pH 7 ステップ 2.2.6 S バッファーとしてを使用して前述のよう R1914E E-PRD 蛋白質を浄化します。蛋白質の貯蔵液は通常約 1 mL のボリュームで 1 mm 0.3 から範囲です。注: 蛋白質に集中することができます > 100 μ M 試料の適切な範囲への集中をもたらすため MWCO 3 kDa、5 mL 遠心限外濾過装置を使用しています。 20 mM トリス-HCl、1 mM DTT、pH 7 ステップ 2.1.10 S バッファーとしてを使用してラベルの VimRod 蛋白質のサンプルを浄化します。 500 μ L の最終巻、最終濃度 100 μ m、20 μ M の最終濃度 10% (v/v)、および DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic 酸) の最終的な集中に重水素酸化物 (D2O) に野生型と変異体の E-PRD タンパク質を追加持参500 μ L までサンプル ボリューム 20 ミリメートル pH 7 1 mM DTT、トリス-HCl を使用しています。代表的なサンプル準備は表 4で説明します。注: 0 ppm DSS の共鳴1H 化学シフトを調整するために使用し同様、タンパク質6シフト15N 化学の間接参照するため。D2O は、一定の純磁気フィールドで動作分析計を維持する重水素ロック信号に使用されます。 前の手順のように O と DSS を E-PRD、D2の 2 番目のサンプルを作り、500 μ L にボリュームを持って来る前に 50 μ M の最終的な集中に VimRod を追加します。 500 μ L のサンプルを実験用 5 mm 広い NMR チューブに転送します。 NMR 実験のセットアップ イジェクト コマンド”ej”; と空気の流れをオンにこれは磁石からサンプルを持ち出すでしょう。今、開始によって磁石の上にスピナーでサンプルを配置し、コマンド”ij”と挿入します。サンプルが進む前に磁石の内部安定するまでを待ちます。 「Edc」コマンドを使用して新しいデータセットを作成し、”ZGPR”(図 1) 実験をクリックして標準の1H-NMR パラメーターを読み込みます。名前、EXPNO (実験数) および PROCNO (処理されたデータ フォルダー番号) フィールドに入力します。「溶媒を設定」フィールドに溶媒を選択し、標準的な probehead と溶媒依存性 (prosol) パラメーターを読み取れません「’getprosol’ を実行する」をクリックします。 サンプルで、重水素化溶媒、すなわちD2O をロック、「ロック」コマンドを使用しそれが完了するまで待つにスイープしロックを実現。 「アートマ」コマンドの自動チューニングを使用してサンプルをチューニングすることによって磁石の共振周波数を修正します。自動調整が完了するまでは、ウォブル曲線を監視します。 TOPSHIM (コマンド”topshim”) を使用して磁場をシムします。Shim は、サンプルのまわりの均一性を達成するために磁場を調整のプロセスです。コマンド「wsh」と shim 値を格納およびそれらを読むことをお勧め同じまたは同じようなサンプルを使用して場合 topshim 前に”rsh の”を使用しています。 最大信号対雑音比を達成するために「rga」コマンドでレシーバーの感度を調整します。 水共振オフセット (o1) のスペクトルの中心を置き、高出力”calibo1p1″を使用して 90 度プロトン パルス (p1) を設定します。 陽子のエネルギー スペクトルのゼロを使用して行く「zg」コマンドと”efp”指数乗算 (“em”)、線幅を組み込む自由誘導減衰 (FID)、”フィート”プロセスで収集フェーズを適用する FID と”pk”のフーリエ変換補正。 自動フェーズ補正”apk”と”absn”統合オプションを使用せず多項式を用いた自動ベースライン補正を適用します。 SOFAST 非実験 (3.2.2) のように新しいデータセットを作成するには、実験で”SFHMQC3GPPH”を選択します。 コピー陽子のエネルギー スペクトルから P1 と O1 を最適化し、コマンド”getprosol 1 H p1 plw1″、p1 は最適化された P1 の値、plw1、P1 のパワー ・ レベルを使用して、P1 依存パルス。 アミド化学シフトのオフセットを設定する CNST54 定数を最適化し、するレシーバーの感度を可能にする興味のスペクトル領域を包含するために帯域幅を定義する CNST55 最適化 (図 2)。これらのパラメーターを選択するには、二次元スペクトルから最初の FID (自由誘導減衰) を抽出し、それらを定義する, 観測信号を探します。さらに、緩和遅延 (D1)、スキャン (NS) とダミー スキャン コマンド”gs”と許容可能な信号感度を得るため (DS) を有効に行くとリアルタイムでデータの品質を監視するスキャンの数をによって異なります。 ゼロ「zg」Go を使用してスペクトルを記録します。 NMR データ処理 直接 F2 のサイズに処理パラメーターを設定 (1H) と間接 F1 (15N) スペクトルによる寸法”SI F2 = 2048、F1 = 512″間接ディメンション (図 3) でオプションの線形予測を用いた。 窓関数として”QSINE”を選択し、二次元スペクトルを処理する 2 の正弦ベル シフト (SSB) を入力します。 ウィンドウ関数とフーリエ変換と双方向でデータを処理するコマンド”xfb”を入力します。 コマンド”apk2d”を使用して、両方向で自動フェーズ補正を実施します。自動プロセスは、位相補正の満足のいくレベルを達成しない場合、「rser」コマンドで Fid を抽出、1 次元処理から相値を計算し、2 D データに適用。 2 D データの自動ベースライン補正機能「abs2」とベースラインを修正します。これは処理パラメーターで定義されている ppm 値間多項式関数を適用し、さらなる分析のための 2次元スペクトルになります。 別の分子との相互作用データの比較のためシリアル処理を実行する場合は、コマンド”wpar”と処理パラメーターを保存し、リコール「rpar」。すべてのデータセットが同じパラメーターとバリエーションで処理されますこの方法では導入されません処理方法の違いのため。 NMR データ分析 ピーク ピッキングのプロセスを開始するコマンド”pp”を入力します。 予想されるピーク (図 4) に基づくピークの ppm の範囲と最小強度/最大数を定義します。[Ok] をクリックし、目視検査による結果を確認します。必要な場合は、スペクトル品質を基に処理結果が満足されるまで再実行します。 “Pp の”コマンドで実測を生成します。メモ: この実測既定データ高さ/ピーク強度情報を含まれていますと後続のスペクトルにエクスポートすることができます、他のプログラムで読み取ることができます。 別の分子との相互作用を示すタンパク質 HSQC スペクトルにおける化学シフトの動きやピーク強度の変化を観察します。相互作用する分子のサイズが大きい場合は、いくつかのピークの消失と共にピーク強度で削減を期待します。 ピーク ウィンドウで右クリックで「ピーク」タブをクリックして、「インポート」を選択することによって次のデータ セットにピーク リストをインポートします。 スペクトルのピークを可視化する新しい位置にそれらを移すために必要な場合。一覧」の「強度をリセットする」をクリックして (図 5) の強度とスペクトル実測を生成します。このピーク ・ リストは、ストアドのピーク ・ リストから位置情報に持ち越されます。 「エクスポート」機能を選択して別のデータセットからスプレッドシートまたは他の数学的な解析プログラムのピークのリストをエクスポートします。 関数「各ピークのタンパク質スペクトルの複雑なスペクトル/ピーク強度のピーク強度」とピーク強度の変化を計算します。値は、掛け算の 100 の変化率に変換できます。ピーク強度が比較的広いピークの高密度タンパク質の場合は、通常、お互いの近くに配置されているピークの測定は容易ですが、ピーク ボリュームは便利なもに注意してください。 4. マイクロ働く (MST) Ligand 蛋白質の E PRD の準備 1 l 20 mM HEPES、pH 7.5、10 mM の NaCl、一晩ゆっくりと 4 ° C で攪拌の中断 3.5 kDa ミニ透析室におけるタンパク質の 800 μ L までおこし、MST 互換性のあるバッファーにリガンドを交換します。 14 000 x g で 10 分間クリーン チューブへの転送高濃度タンパク質で遠心分離遠心限外濾過ユニット (MWCO 3 kDa) を用いたリガンドを集中します。 21,000 × g 10 分間に存在するリガンドを遠心し、慎重に任意の沈殿したタンパク質を削除する新しいチューブに上清を転送します。280 吸光度を用いたリガンドの濃度を決定する nm と配位子吸光係数。10% 追加トゥイーン-20 0.015% の最終的な集中を与えるため。トゥイーン 20 は、毛細血管への吸着を防ぐためにアッセイバッファーに追加されます。MST の実験に使用される最終的なアッセイ バッファーが 20 mM HEPES、pH 7.5、10 mM の NaCl、0.015% Tween 20。 ターゲットの色素標識タンパク質 VimRod の作製 1x PBS T が 5 μ M の濃度を与える赤トリス NTA に付属の 50 μ L を追加することで赤トリス NTA 染料を再構成します。200 μ L のチューブに 2 μ 因数を省略し、-20 ° C で保存 アッセイバッファーで 0.34 μ m までターゲット蛋白質を希釈します。赤トリス NTA 色素の 2 μ 因数にターゲットの 58 μ L を追加し、室温で 30 分間インキュベートします。染め分類されたターゲットの最終濃度は 0.33 μ M です。10 分 21,000 x g でラベル付けされたターゲットを遠心し、慎重に任意の沈殿物を削除する新しいチューブに上清を転送します。赤トリス NTA 色素は His6 タグによるタンパク質に結合し、結合解離定数 (KD) は、サブ ナノモル範囲。それは効果的に 100% ターゲット蛋白質に連結されているので、さらに浄化する必要はありません。 MST の楽器、コントロール ソフトウェアを開きます。赤トリス NTA 色素の赤の設定を選択します。25 ° c. に温度制御をオンに ターゲットのラベルを検証する予備を選択し、集約やキュヴェットへの吸着を確認します。これらのパラメーターの評価が自動的に提供されます。 ミックス 17 μ L アッセイバッファーのターゲット蛋白質のピペッティングによるミックス 3 μ L。希薄化後のターゲットのそれらを浸すことと毛細血管の中心に液体を描画によって 2 つの標準的な毛細血管を記入してください。トレイと楽器には、毛細血管を配置します。測定を開始します。 蛍光の十分なレベルと吸着 (キャピラリー ライン形状の歪み) の兆候を探して結果を確認または集計 (MST トレースの歪み) ソフトウェアの分析でフラグが設定されます。結果が肯定的な移動場合手順、そうでない場合は別のバッファーにリガンドを試して必要があります。 または 0.05% 以上、トゥイーン 20 の量を増やすことができます。 E PRD 配位子の 2 倍希釈系列の作製 16 の分類によって希釈系列を調製する 1 月 16 日から 200 μ L チューブ。 Tube1 に必要な最大リガンド濃度よりも高い濃度 × 1.17 でリガンドの 17 μ L を追加します。このボリュームは、2 倍量必要 (8.5 μ L)、因数は次の管を直列に転送されます。アッセイの最終巻は、ターゲット蛋白質の VimRod の 1.5 μ L 添加による 1 倍に希釈され 1.17 x リガンド濃度 8.5 μ 10 μ L です。選択この最大濃度は、20 回以上推定 KDの値をする必要があります。 Tubes2-16 新しいピペット チップを用いた各因数にアッセイバッファーの 8.5 μ L を追加します。ピペット チップを再利用 (正確な分注を参照してください製造元の指示に関するアドバイス) の精度に影響することができます。ゆっくりと泡を生成することがなく、アッセイバッファーにソリューションをリリース Tube2 に Tube1 からリガンドの 8.5 μ L を転送します。泡を発生させることがなく、上下に少なくとも 6 回を再びにピペッティングによるリガンドとバッファーをミックスします。最も集中管 E PRD 1.5 mM, ラベル付きの VimRod 50 の最終濃度に存在していた nM。 Tube2 からリガンドの 8.5 μ L を Tube3 に転送し、アッセイバッファー ミックスします。シリアル希釈を繰り返してすべてのチューブを持っている配位子を追加します。すべてのチューブの 2 倍希釈系列のリガンドの 8.5 μ L が含まれるように Tube16 から 8.5 μ L を破棄します。 MST と結合反応実験の準備 チューブのそれぞれにラベル付きターゲット蛋白質の 1.5 μ L を追加、軽く泡を避けるように注意しながら上下ピペッティングで混ぜます。15 分間インキュベートします。 結合の試金のためのエキスパート モードを選択し、シリアル希釈系列のパラメーターに入力します。温度制御の設定を確認してください 25 ° C、励振電力 40% と MST 電源を媒体に設定されています。これらのパラメーターは、研究されている他の結合パートナーの最適化する必要があります。 結合反応で毛細血管を埋めるし、キャピラリーのトレイに配置。楽器にトレイをロードは、温度 25 ° C を取り戻すし、測定を開始するを待ちます。 データ分析 アフィニ ティー解析ソフトウェアでバインディング アッセイ ファイルを開きます。キャピラリーのスキャンを確認します。蛍光レベル平均値からの 10% 以上に変わらないように、セクション 3.6 で説明されているようにする必要がありますが検出されない集計または吸着。 右側のパネルに MST 分析を選択して、分析データを分析セットにドラッグします。同じ条件下で同じターゲット-リガンド結合アッセイ法の複数の実行がある場合は、同じセットにドロップすることによって結合できます。また、実行のたびにドロップできるない解析独立。 データのグラフを用量応答フィット] タブに移動します。単一のバインディング サイトが予想される場合は、KDモデルを選択します。丘モデルはまた協調行動を持つ複数の結合サイトのためのオプションです。品質管理を通過しなかった外れ値のポイントは、この段階でフィットから削除できます。マージ複数のアッセイとセットが平均してエラーは標準偏差として計算されます。 最後のタブを開き、1 つのグラフのすべてのプロット間で結果を比較します。生成されるテーブルから各曲線の近似の結果を取得します。必要な場合に、データまたは近似曲線を他のプレゼンテーションや分析ソフトウェアにエクスポートします。