Qui, presentiamo un protocollo per la produzione e purificazione di proteine che sono etichettati con isotopi stabili e successiva caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala Esperimenti di Termoforesi (MST).
Proteine filamentose come vimentin forniscono organizzazione all’interno delle cellule fornendo un’impalcatura strutturale con siti che legano proteine contenenti plakin si ripete. Qui, un protocollo per la rilevazione e la misurazione di tali interazioni è descritto utilizzando il dominio di ripetere plakin globulare di envoplakin e la bobina elicoidale di vimentina. Questo fornisce una base per determinare se una proteina si lega il vimentin (o simili proteine filamentose) e per la misura dell’affinità dell’interazione. La proteina globulare di interesse è etichettata con 15N e titolata con il vimentin proteina in soluzione. Uno spettro NMR bidimensionale viene acquisito per rilevare interazioni osservando cambiamenti in forma di picco o spostamenti chimici e per chiarire gli effetti delle condizioni di soluzione tra cui livelli di sale, che influenzano la struttura quaternaria vimentin. Se la proteina di interesse si lega il ligando filamentoso, l’interazione di associazione è quantificato dal MST utilizzando le proteine purificate. L’approccio è un modo semplice per determinare se una proteina di interesse viene associata un filamento e valutare come alterazioni, quali mutazioni o condizioni di soluzione, influenzano l’interazione.
Interazioni tra proteine permettono la formazione di macchine molecolari che creano ordine all’interno delle cellule. Le interazioni individuali sono spesso deboli ma solitamente contribuiscono a complessi polivalenti che possono essere cooperativo e dinamicamente regolato. Saggi sensibili che forniscono risoluzione atomica e informazioni quantitative su tali interazioni complesse sono necessari meccanismi di dedurre e progettare interventi quali molecole di droga-come. La spettroscopia NMR è un metodo efficiente per ottenere tali informazioni sulle interazioni della proteina e inoltre è usata per lo screening rapido per ligandi compresi quelli che legano debolmente1. I metodi di NMR utilizzati possono essere classificati in quelli che sono proteine osservare o ligando osservare. Questo manoscritto utilizza il primo approccio in cui viene acquisito un spettro di un isotopo stabile con l’etichetta della proteina che è relativamente piccola (solitamente sotto 20 kDa) e il ligando adenoida è titolato. In questo modo i residui con etichettati coinvolti nell’interazione deve essere mappato in casi favorevoli. Una volta le forme complesse, ci sono cambiamenti in ambienti chimici dei residui d’interazione che si manifestano come variazioni lo spostamento chimico e la forma dei loro segnali NMR. La portata di tali modifiche si correla con il grado di coinvolgimento di questi gruppi nell’interazione. Perturbazioni di spostamento chimico (CSP) possono essere misurati confrontando una serie di spettri NMR della proteina raccolti in assenza e in presenza di quantità variabili di ligando. Per ligandi più grandi o complesse interazioni, il cambiamento nella forma di picco o l’intensità può essere misurato per dedurre le interazioni.
L’esperimento 2D più comune utilizzato per la rilevazione di interazioni ligando è l’esperimento di 15N-eteronucleari singolo quantum correlazione (HSQC)2. Questo richiede che una proteina uniformemente essere etichettati con 15N, che è tipicamente realizzato di esprimerle come affinità-tagged versioni in colture batteriche di Escherichia coli coltivate in 15media N-arricchita. Associazione è apparente quando gli spettri HSQC raccolti durante la titolazione si sovrappongono, rivelando le modifiche di picco per un sottoinsieme dei residui coinvolti nella formazione complessa. L’interazione può verificarsi in regime di scambio veloce dove i segnali di stato libero e ligando-saturi collassano in una popolazione media di picco. In alternativa, nel caso di lenti scambi tra gli Stati, entrambi i segnali sono osservati con integrali che rappresentano i loro importi relativi. Mentre analisi lineshape NMR possono essere utilizzato per stimare le affinità di legame in alcuni casi, metodi quali MST inoltre hanno provato comodi e forniscono la convalida incrociata delle interazioni genuini.
L’esempio fornito è di due proteine che si trovano all’interno di desmosomi. Essi mediare giunzioni tra superfici delle cellule e del citoscheletro e mediare multivalenti interazioni tra macchine di adesione delle cellule e filamenti intermedi per mantenere l’integrità della pelle e tessuti del cuore e sopportare di elevate forze di taglio. Quando le proteine desmosomiali come desmoplakina o il vimentin sono compromessi da mutazioni o autoanticorpi, che conduce alla destabilizzazione delle giunzioni cellula-cellula, e quindi le loro interazioni sono di importanza critica3, possono provocare malattie. La base strutturale del ligando di proteine desmosomiali può essere caratterizzata dalla spettroscopia NMR, mentre le interazioni possono essere quantificate da MST. Metodi nel presente documento sono stati usati per caratterizzare le interazioni tra domini ripetere plakin (MDP) che spesso sono presenti come insiemi di tandem che offrono scanalature di base e il vimentin, un filamento intermedio che interagisce attraverso una superficie acida offerta dalla sua elicoidale Bundle4. Questi complessi sono formati alla membrana cellulare dove di ancoraggio per i filamenti intermedi del citoscheletro delle cellule a desmosomi che collegano alle celle adiacenti, formando così una rete di legami adesivi che si irradia durante un tessuto.
Il 2D 15esperimento NMR N-risolto è uno dei più diffusi metodi per mostrare come due molecole interagiscono. È il metodo più ricco di informazioni che permette segnali di entrambi i partner di essere continuamente monitorati nel corso di un esperimento di titolazione in stato di soluzione. Anche se in genere qualitativa nel caso di grandi complessi, il metodo utilizzabile anche in casi favorevoli per misurare l’affinità di legame dove segnali NMR possono essere rintracciati in spettri ad alta risoluzione. Quando le assegnazioni possono essere fatte convenientemente, come nel caso di molte proteine sotto 20 kDa in dimensione, i siti di legame possono essere mappati. Saggi complementari quali MST forniscono informazioni quantitative sulle interazioni in soluzione e richiedono meno proteine negli Stati senza etichetta. Confronto di mutanti di associazione dei dati è utile per fornire controlli per garantire che le interazioni evidenziati dalla linea NMR ampliamento sono genuini e non artefatti di, ad esempio, le modifiche di aggregazione o viscosità.
Espressione della proteina
Semplificazione del processo di espressione riduce la quantità di produzione di proteine intensivo di manodopera. Parte di questo processo di ottimizzazione prevede l’individuazione di un appropriato ceppo di e. coli per l’espressione recombinant della proteina. Preferenza di ceppo dipende da elementi compresa la natura del vettore in uso e, più specificamente, il massimo della stabilità della proteina ricombinante è espresso7. Il rischio di degradazione della proteina eterologa da endogeno e. coli possono essere ridotto uso della proteasi proteasi carenti e. coli come il ceppo BL21. Per geni contenenti codoni rari, un ceppo ad esempio RIPL BL21-CodonPlus (DE3) può essere preferito. Questo ceppo unisce la natura carente di proteasi del ceppo BL21 copie aggiuntive endogeno del codone rara tRNAs per leucina, isoleucina, prolina e arginina. In alternativa, è possibile evitare codoni rari che possono compromettere la sovraespressione ordinando un costrutto codone-ottimizzato da una fonte commerciale. Molti ceppi di e. coli sono disponibili per l’espressione genica ricombinante, ciascuno ottimizzato per elusione di un particolare problema durante espressione7. Nel caso di questo studio, il ceppo carente di proteasi standard BL21 (DE3) prodotto quantità adeguate di proteine solubili per purificazione successiva e analisi.
Purificazione della proteina
Il protocollo di purificazione per una data proteina spesso è unico nel senso che ogni proteina rimane stabile e solubile in diverse condizioni quali temperatura, concentrazione di sale o pH. L’efficacia complessiva della purificazione mediante cromatografia di affinità è anche sensibile alla concentrazione di eluizione specie come imidazolo alle varie fasi durante il processo di purificazione. In questo lavoro, condizioni di buffer critico per IMAC erano pH per l’E-PRD e la concentrazione di imidazolo per il VimRod. Un pH di 7,5 era necessario per evitare la precipitazione del E-PRD seguendo eluizione iniziale dalla colonna IMAC. Per la purificazione di IMAC di VimRod, aumentando la concentrazione di imidazolo da 30 a 50 mM durante la fase di lavaggio della colonna è stato trovato per avere un miglioramento sostanza nella purezza delle frazioni eluizione finale. Per il passaggio di eluizione, anche aumentando la concentrazione di imidazolo da 250 a 350 mM è stato trovato per migliorare la resa dell’eluizione finale. I tentativi iniziali di eluire la proteina usando imidazolo 250 mM ha portato alla incompleta eluizione di VimRod come rivelato da una striscia di imidazolo 1m finale della colonna (dati non mostrati). Aumento della concentrazione di imidazolo e 350 mM per l’eluizione è stata sufficiente a recuperare tutta la proteina associata alla colonna. S può avere una duplice funzione perché agisce come un passaggio di lucidatura per purificazione della proteina durante l’esecuzione contemporaneamente cambio di buffer. Cambio di buffer è un passo fondamentale per l’analisi successiva associazione poiché rimuove l’imidazolo utilizzato per eluire la proteina His6-etichetta. Serve anche come un’opportunità per cambiare le condizioni come la concentrazione di sale o pH, che possono influenzare l’efficacia di determinate tecniche a valle o saggi. Proteina spostamento termico (PTS) può essere utilizzato per identificare il buffer ottimale per i dosaggi a valle, soprattutto per coloro che necessitano di proteina stabile per prolungati periodi di tempo a temperatura ambiente8,9.
Analisi di associazione
Proteina che viene preparata al momento è critica per analisi accurata obbligatorie, anche se congelata proteina può essere usato anche come i risultati vengono confrontati. Proteine filamentose come vimentin multimerize in un modo dipendente dalla sale e pH, e quindi la soluzione c’è bisogno di essere ottimizzato e oligomerico stato stimato da un metodo quale SEC10,11, dynamic light scattering condizione 12 o ultracentrifugazione analitica13,14,15. La spettroscopia NMR è adatta per la misurazione interazioni ligando di piccole proteine a risoluzione atomica. Tuttavia, quando una proteina interagisce con la molecola più grande, più lento barilatura deriva, e ciò si traduce in perdita di segnali, che può confermare l’associazione anche se esso non necessariamente consentire il mapping dei siti, che richiederebbero anche assegnazione di almeno di legame spina dorsale risonanze. In questo scenario, gli esperimenti NMR non consentono l’identificazione del sito di interazione. Quindi il sito diretto mutagenesi viene applicata per identificare i residui critici necessari per l’associazione. Tali mutanti pertanto non manifestano perdita di segnale. In questo protocollo, una forma mutante con una sostituzione alla posizione 1914 mantiene le intensità di picco in presenza di VimRod e conferma pertanto la rottura dell’interazione di E-PRD e VimRod. Assegnazione delle risonanze sidechain e backbone vorrei aggiungere valore a questo approccio, in particolare come la struttura per il gratuito E-PRD è stata risolta dalla cristallografia a raggi x4. Future applicazioni di RMN comprendono la caratterizzazione delle interazioni complesse fra le più grandi molecole e potranno beneficiare di magneti di campo ultra alto e l’uso di altri gruppi osservabile come 13C-etichetta e gruppi metile trifluoro come reporter.
MST ha una serie di vantaggi per lo studio di associazione interazioni16. I soci di associazione sono liberi in soluzione e non immobilizzati. Analisi della qualità dei campioni sono incorporata nel software con controllo qualità reporting dell’aggregazione, adsorbimento al capillari o insufficiente etichettatura fluorescente della molecola target. Piccole quantità di destinazione vengono in genere utilizzati, la concentrazione del target con etichetta è di solito tra 20-50 nM in un 10-20 μL volume/reazione. Questo protocollo utilizza volumi di reazione molto piccolo (10 μL) per massimizzare la concentrazione del ligando che possa essere raggiunti nelle titolazioni consentendo l’interazione di legame debole essere caratterizzato. Ciò richiede di pipettaggio accurata e la cura per evitare di introdurre bolle, mescolando ancora accuratamente. Miscelazione adeguata è fondamentale per misure di fluorescenza preciso, coerente lungo la serie di diluizioni seriali. La quantità di Tween-20 negli esperimenti MST è stato ridotto da standard 0.05-0.015% per ridurre la tendenza a creare bolle e migliorare la miscelazione.
Il colorante rosso-Tris-NTA fornisce un modo rapido, facile e conveniente per fluorescente etichettare qualsiasi proteina che ha una sua etichetta. L’etichettatura è effettivamente completo in soli 30 minuti ed è molto stretto in modo che non è necessaria alcuna procedura di rimozione tintura. Non sono modifiche ai residui dell’amminoacido nella proteina che potrebbe alterare le proprietà di legame del ligando. Un avvertimento è che solo la proteina di essere etichettato dovrebbe avere un tag His6. Ciò ha richiesto la scissione del tag dalla proteina legante, E-PRD e la rimozione del tag e ApoAlert E-PRD con un secondo passaggio di colonna IMAC. Se possibile, la proteina legante dovrebbe essere preparata senza l’uso di un suo tag. In alternativa, proteine possono essere etichettate in modo covalente con un fluoroforo attraverso ammina accoppiamento a residui di lisina o del tiolo di accoppiamento a residui di cisteina. Tuttavia, è necessario prestare attenzione quando l’utilizzo di tali sistemi dal collegamento covalente di un fluoroforo può influenzare interazioni elettrostatiche o polare associazione basandosi sui residui di lisina o cisteina. La quantificazione delle affinità tra la VimRod ed E-PRD da MST obbligatoria era insolitamente sensibile alla concentrazione di sale. Questo problema è stato attenuato da dialisi inizialmente la destinazione e il ligando in stesso lotto di tampone del saggio. Ciò nonostante, saturazione della curva associazione MST non poteva essere raggiunti quando si esegue il test di MST in presenza di 150 mM NaCl, a causa del comportamento complesso di VimRod. Dati affidabili e completi è stati ottenuti una volta che la concentrazione di NaCl è stata abbassata a 10 mM che permette il calcolo preciso della KD. Quindi, attenta ottimizzazione delle condizioni di soluzione e confronto con saggi complementari sono raccomandato per ottenere risultati affidabili. Inoltre, MST può essere usato per quantificare la dipendenza del sale per un’interazione specificata, quantificare stechiometrico proprietà delle interazioni della proteina, monitor il protein folding e sonda in enzima cinetica17.
The authors have nothing to disclose.
Questo progetto è stato supportato da NSERC RGPIN-2018-04994, Campus Alberta Innovation Program (RCP-12-002C) e Alberta Prion Research Institute / soluzioni di Alberta Innova Bio (201600018), assegnato a Mangano e Genome Canada e Fondazione canadese per Sovvenzioni di innovazione per la metabolomica Innovation Centre (TMIC) e NANUC.
Monolith NT.115, includes control and analysis software | NanoTemper Technologies | MO-G008 | Instrument for microscal thermophoresis |
His-Tag Labeling Kit RED-Tris-NTA | NanoTemper Technologies | MO-L008 | RED-tris-NTA dye for MST |
Standard capillaries | NanoTemper Technologies | MO-K022 | capillaries for MST |
HisTrap HP, 5 mL | GE Healthcare | 17524801 | IMAC column |
HisPur Ni-NTA resin, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 88222 | IMAC resin |
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | SEC column |
TEV protease | Sigma Aldrich | T4455 | cleavage of his tag from E-PRD |
BL21(DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527H | cells for protein expression |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets EDTA-Free | Sigma Aldrich | 11873580001 | protease inhibitors for protein purification by IMAC |
TCEP, Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706 | reducing agent for protein purification |
Reagents (HEPES, NaCl, etc) | Sigma Aldrich | various | Preparation of media and buffers |
Ammonium chloride (15N, 99%) | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 | isotope labelling for NMR |
D2O, Deuterium Oxide (D, 99.8%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-2259 | NMR sample preparation |
DSS, Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-D6 (D,98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-8206 | reference for NMR |
Precision 5 mm NMR Tubes, 7” long | SJM/Deuterotubes | BOROECO-5-7 | NMR tubes |
NMR spectrometer (14.1 Tesla) | Bruker | acquisition of NMR data | |
TCI 5mm z-PFG cryogenic probe | Bruker | acquisition of NMR data | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Bruker TopSpin 4.0.1 | Bruker | processing of NMR data | |
MO.Control | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 | |
MO.Affinity Analysis | NanoTemper Technologies | included with Monlith NT.115 |