Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

1. rekombinant Protein ifade Envoplakin PRD (E-PRD) ve Vimentin 99-249 (VimRod) ifadesi E. coli BL21(DE3) hücreleri istenilen gen içeren plazmid ile dönüşümü. Ağar kaplamalar 100 µg/mL ampisilin içeren hücrelerin yayıldı. Plakayı 37 ° C’de gecede kuluçkaya. Bir koloni almak ve müthiş suyu (TB) plazmid için seçmek için 100 µg/mL ampisilin içeren 20 mL aşılamak. Kültür 37 ° C’de (180 rpm) gecede sallayarak ile büyümek. Tüm 20 mL kültür için 1 L 50 µg/mL ampisilin içeren TB aktarın. 180 rpm kadar OD600 sallayarak ile kültür 37 ° C’de kuluçkaya 0,6-0,8 =. Sıcaklık 18 ° C-azaltmak ve protein ifade izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ekleyerek 1 mM son bir konsantrasyon için ikna etmek. Kuluçka 18 ° C’de 160 protein ifade izin vermek için devir / dakikada gecede sallayarak ile devam edin. 15 dk. Decant 8000 x g de kültür centrifuging tarafından hücreleri hasat ve süpernatant atın. Yıkama hücre Pelet fosfat yaklaşık 40 mL resuspending tarafından hasat hücreleri tamponlu tuz çözüm (PBS: 20 mM fosfat tampon, pH 7.4, 120 mM NaCl). Resuspension 50 mL tüp aktarın. Santrifüj tekrar 8.000 x g de 15 dakika. Dikkatle boşaltmak ve süpernatant atın. Ya hemen arıtma Protokolü başlamak ya da hücre topakları ileride kullanmak için-20 ° C’de dondurmak. İfade Isotopically etiketli protein E. coli BL21(DE3) hücreleri dönüştürme ve 1.1.1-1.1.2 olduğu gibi 20 mL starter kültür hazırlamak. Tüm 20 mL kültür 1 litre zenginleştirilmiş TB bir ek 4.0 g tryptone, 5.0 g NaCl ve 100 µg/mL ampisilin içeren aktarın. 160 rpm’de kadar OD600 sallayarak ile kültür 37 ° C’de kuluçkaya 1,6-1,9 =. Santrifüjü 8000 x g 15 dk. Decant de tarafından 1 L kültür hasat ve süpernatant atın. Yavaşça PBS yaklaşık 40 mL resuspending tarafından hücre Pelet yıkama ve resuspension 50 mL tüp aktarmak. 8000 x g 15 dk. Decant için de yine santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücre Pelet M9 en az medya (Tablo 1) ve transfer geri kalanına 100 µg/mL ampisilin içeren M9 en az medya 950 mL 20 ml resuspend. 50 mL steril filtre besin karışımı (Tablo 2 ve 3) ekleyin. 18 ° c 30 dk için kültür IPTG 1 mM son bir konsantrasyon için eklemeden önce parkenizin. Gecede 18 ° C’de 160 rpm’de sallayarak ile kuluçkaya. Bölüm 1.1.4-1.1.6 olduğu gibi hücre hasat. 2. Metal benzeşme Kromatografi (IMAC) arıtma VimRod ve E-PRD immobilize His6 öğesini VimRod arıtma Hücre Pelet 5 mL/g proteaz inhibitörü kokteyl eksik EDTA içeren PBS içinde resuspend. Aşağıdaki adımda hücre lizis geliştirmek için bir Dounce doku homogenizer 12 darbeleri ile homojenize. Buz üzerinde kapalı hücre süspansiyon 1 s/1 s bir darbede solüsyon içeren temizleyicide, % 80 genlik 1,5 dk. toplam süreleri, aşırı ısınmayı önlemek için çalıştırma arasında buzda yavaşça dönen iki ek sonication tekrar. 75.000 x g 45 dk. Decant için de örnek santrifüj kapasitesi ve bir şırınga filtre (0,45 µm) kullanarak süpernatant filtre. 5 mL IMAC sütun bağlama arabellek (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole) 1 mL/dk hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi kullanarak akış hızında 5 sütun cilt (CV) ile equilibrate. Filtre uygulanmış süpernatant 0.5 mL/dk akış hızında sütuna yerleştirin. Sütun 5, CV yıkama arabellek (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole) ile 1 mL/dk debi yıkayın. Protein 3 ile elute CV elüsyon arabelleği (20 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM NaCl, 350 mM imidazole) 0.5 mL/dak toplamak 1.5 mL kesirler akış hızında. Varsa, eluted protein konsantrasyonu artırmak için yukarı akış elüsyon modunu seçin. Protein konsantrasyonu5ölçmek için standart yöntemleri kullanın ve SDS-sayfa tarafından ilgi protein içeren kesirleri FPLC kromatografik üzerinden tanımlayın. Havuz ve bir santrifüj ultrafiltrasyon (MWCO 3 kDa, 5 mL) 2 ml aygıtıyla protein yüksek miktarda içeren elüsyon kesirler konsantre. Herhangi bir çökelti kaldırmak ve 0,22 mikron filtre üzerinden geçmek 21.000 x g, santrifüj kapasitesi. 120 mL boyutu dışlama Kromatografi (S) sütun 1 mL/dak bir FPLC kullanarak akış hızında 2 S CV arabelleği (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP) ile equilibrate. 2.1.9 sütuna yoğun protein enjekte edip 1 S CV arabelleği akış hızı 0.5 mL/dk, 1 mL kesirleri toplama, ile elute. Önce ilgi protein içeren kesirleri tanımlayın. En yüksek miktarda protein içeren kesirleri havuz. Kısa süreli kullanım için 4 ° C’de depolayın veya % 20 ve mağaza içinde küçük aliquots-80 ° C’de gliserol ekleyin. E-PRD Protein kaldırıldı His6 etiketi ile saflaştırılması 2.1.1-2.1.8 His6 öğesini E-PRD protein arındırmak için adımları izleyin. Tepe kesirler havuz ve protein konsantrasyonu belirlemek. Tütün eklemek virüs (TEV) proteaz (1 mg/mL) 2 µL/mg havuza alınan protein etch. (6 kDa) boru diyalize aktarmak ve gecede 4 ° C’de S arabellekte diyaliz Bu adımı His6 etiketinin bölünme ve Ni-NTA reçine sonraki adımda bağlama çalışmasına engel imidazole kaldırılmasını sağlar. Ni-NTA reçine bir yerçekimi sütun 3 S CV arabelleği ile 5 mL equilibrate. Drenaj reçine aşırı arabelleğinden. Cleaved E-PRD protein reçine üzerine dökün ve 1 saat uncleaved His6 öğesini E-PRD ve cleaved His6 etiket bağlamak izin vermek için sallanan bir platform üzerinde kuluçkaya. TEV proteaz da His6 öğesini ve reçine bağlamak olacak. Aracılığıyla akış toplamak, hangi etiket Ücretsiz E-PRD içerir. Tüm E-PRD sağlamak için yıkama reçine ile 2 S CV arabellek kurtarılır. E-PRD ile akışı 2 ml (MWCO 3 kDa, 5 mL) bir santrifüj Ultrafiltrasyon aygıtı kullanarak konsantre. Herhangi bir çökelti kaldırmak ve 0,22 mikron filtre üzerinden geçmek için 21 000 x g, santrifüj kapasitesi. 120 mL S sütun 1 mL/dak bir FPLC kullanarak akış hızında 2 S CV arabelleği (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5, 0,5 mM TCEP MST veya 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 NMR için) ile equilibrate. 2.2.5 sütuna konsantre E-PRD protein enjekte edip 1 S CV arabelleği akış hızı 0.5 mL/dk, 1 mL kesirleri toplama, ile elute. Önce ilgi protein içeren kesirleri tanımlayın. En yüksek miktarda protein içeren kesirleri havuz. Kısa süreli kullanım için 4 ° C’de depolayın veya % 20 ve mağaza içinde küçük aliquots-80 ° C’de gliserol ekleyin. 3. NMR yöntemleri NMR numune hazırlama 15N etiketli vahşi-türü veya R1914E E-PRD protein 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 adım 2.2.6 S tampon olarak kullanarak daha önce açıklandığı gibi arındırmak. Protein hisse senedi çözümleri 0,3 yaklaşık 1 mL hacimleri ile 1 mM için genellikle aralığı.Not: Protein için konsantre olabilir > 100 µM numune hazırlama için konsantrasyon uygun bir aralığın içine getirmek için bir MWCO 3 kDa, 5 mL santrifüj Ultrafiltrasyon aygıt kullanarak. 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 adım 2.1.10 S tampon olarak kullanarak etiketsiz VimRod protein örneği arındırmak. 500 µL son hacmi içinde 100µM, döteryum oksit (D2O) % 10 (v/v) ve DSS (4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic asit) son bir konsantrasyon 20 µM. son bir konsantrasyon için son bir konsantrasyon vahşi-türü veya mutant E-PRD protein eklemek Bring numune hacmi 500 µL kadar 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 kullanarak. Bir temsili numune hazırlama Tablo 4′ te açıklanmıştır.Not: 0 ppm rezonans DSS 1H kimyasal vardiya kalibre için kullanılır hem de dolaylı 15N kimyasal başvurmak için protein6/ vardiya. D2O döteryum kilit sinyal için manyetik alan net bir sabit çalışma Spektrometre tutmak için kullanılır. E-PRD, D2ikinci bir örnek kadar önceki adımı olduğu gibi O ve DSS yapmak ve 50 µM 500 µL kadar ses getiren önce son bir konsantrasyon VimRod ekleyin. 500 µL örnekleri 5 mm geniş NMR tüpler deneme için transfer. NMR deneysel Kur Çıkarma komutu “ej”; hava akışına açmak Bu mıknatıs örnek getirecektir. Şimdi, örnek bir spinner mıknatıs üstüne içinde tarafından açılış ve komut “IJ” yerleştirin. Devam etmeden önce mıknatıs içinde örnek yerleşir kadar bekleyin. “Edc” komutunu kullanarak yeni bir veri kümesi oluşturun ve standart 1H NMR parametreleri deney seçerek “ZGPR” (Şekil 1) yükleyin. ADI, EXPNO (deney numarası) ve PROCNO (işlenen verileri dizin numarası) alanlarını doldurun. Çözücü “solvent ayarla” alanında seçin ve “üzerinde ‘getprosol'” standart probehead ve solvent bağımlı (prosol) parametreleri okumak için tıklatınyürütmek. Deuterated solvent, Yani, D2O örneğe kilit, “kilit” komutunu kullanarak ve bu bitinceye kadar bekleyin süpürme ve kilit elde eder. Mıknatıs rezonans frekansı otomatik ayarlama komutu “atma” kullanarak örnek ayarlama tarafından düzeltin. Otomatik ayarlama işlemi tamamlanana sallantı eğrisi izlemek. TOPSHIM (komut “topshim”) kullanarak manyetik alan dolgu. Titremeden manyetik alan örnek çevresinde bütünlük elde etmek için ayarlamalar süreçtir. “Wsh” komutu ile dolgu değerleri depolamak ve onları okumak için iyi bir yöntemdir “rsh” topshim önce aynı veya benzer örnekleri kullanıyorsanız kullanarak. Alıcı kazanç “rga” komutuyla en yüksek sinyal gürültü oranı elde etmek için ayarlayın. Spektrumunun merkezine su rezonans uzaklık (o1) yerleştirin ve “calibo1p1” kullanarak yüksek güçte 90 derece proton darbe (p1) ayarlayın. Toplamak proton spektrumu hazırlamalıyım sıfır kullanarak gitmek “zg” komutu ve oluşum “içeren üstel çarpma (“em”), ücretsiz indüksiyon çürüme (FID) hattı genişletmeyi birleşmeyle,”ft”e.f.P’yi” ile FID ve “pk” faz uygulamak için fourier dönüşümü Düzeltme. Otomatik Faz düzeltme “apk” ve “absn” polinom tümleştirme seçeneği olmadan kullanarak otomatik temel düzeltme uygulayın. Yeni bir veri kümesi (olduğu gibi 3.2.2) SOFAST HMBC deneme için deneyde “SFHMQC3GPPH” seçerek oluşturun. Kopya P1 ve O1 proton spektrum en iyi duruma getirilmiş ve P1 bağımlı bakliyat burada p1 en iyi duruma getirilmiş P1 değeri, plw1 güç düzeyi P1 için komut “getprosol 1 H p1 plw1”, kullanarak doldurun. CNST54 sabiti Amid kimyasal shift kenardan uzaklığı ayarlamak için en iyi duruma getirmek ve CNST55 olmak alıcı kazanç sağlayan faiz spektral bölgelerin kapsayacak için bant genişliğini tanımlamak üzere optimize edilmiştir (Şekil 2). Bu parametreleri seçmek için ilk FID (ücretsiz indüksiyon decay) iki boyutlu spektrum ayıklamak ve onları tanımlamak gözlenen sinyal için bak. Buna ek olarak, gevşeme gecikme (D1), numarasını inceden inceye gözden geçirmek (NS) ve hangi olanaklı kılmak gidin ve veri kalitesi gerçek zamanlı olarak izlemek için tarama kukla taramaları (DS) komut “g”, kabul edilebilir sinyal hassasiyet elde etmek için farklı. “Zg” mı kullanarak spectra kaydedin. NMR veri işleme İşleme parametreleri doğrudan F2 boyuta ayarlayın (1H) ve dolaylı F1 spektrum kullanımının (15N) Boyutlar “SI F2 = 2048, F1 512 =” dolaylı boyut (Şekil 3) isteğe bağlı doğrusal tahmin ile. “QSINE” pencere işlev seçin ve 2. iki boyutlu spektrum işlemek için bir sinüs çan kayma (SSB) girin. “Komut xfb pencere fonksiyonu ve fourier dönüşümü ile her iki yönde verileri işlemek için” girin. Her iki yönde otomatik faz düzeltme gerçekleştirmek için “apk2d” komutunu kullanın. Otomatik işlemi faz düzeltme tatmin edici bir düzeyde sağlamak değil, “rser” komutu ile FID’ler ayıklamak, 1 D işleme faz değerleri hesaplamak ve 2D veri uygulayabilirsiniz. Temel 2D verileri için otomatik temel düzeltme fonksiyonu “abs2” ile düzeltin. Bu işleme parametrelerinde tanımlanan ppm değerleri arasında polinom işlevi uygular ve daha fazla çözümleme için 2D bir spektrum üretecek. Eğer başka bir molekül ile etkileşim veri karşılaştırma için seri işlem gerçekleştirmek planlama, “wpar” komutu ile işleme parametreleri depolamak ve onları “rpar” geri. Tüm veri kümeleri aynı parametreleri ve çeşitleri ile işlenebilir bu şekilde farklılıklar işleme nedeniyle tanıtılacaktır değil. NMR veri analizi En yüksek malzeme çekme işlemine başlamak için “komut s” girin. Beklenen tepeler (Şekil 4) dayalı doruklarına ppm aralığı ve en düşük yoğunluk/maksimum sayı tanımlayın. Tamam’ı tıklatın ve sonuçları görsel denetim tarafından doğrulayın. Gerekli spectra kalitesine bağlı sonuçlar tatmin edici olana işlemi yeniden çalıştırın. “S” komutu ile bir peaklist oluşturur.Not: Bu peaklist varsayılan olarak veri yükseklik/en yüksek yoğunluk bilgileri içerir ve sonraki spektrumu için ihraç edilebilir ve diğer programlar tarafından okunabilir. En yüksek yoğunluklarda değişiklikleri veya başka bir molekül ile etkileşim göstermek protein HSQC spectra kimyasal nöbetleşe hareketinde gözlemlemek. Etkileşen molekül büyükse indirimleri bazı doruklarına ortadan kaybolması ile birlikte en yüksek yoğunluklarda bekliyoruz. Sonraki veri kümesi için en yüksek listesi doruklarına penceresinde bir sağ tıklama ile “tepeler” sekmesini tıklayarak ve “alma” seçerek alın. Tepeler üzerinde spektrum görselleştirmek ve onları yeni konumlara vardiya gerekirse. Tıkırtı üstünde “için tam bir tablo” “reset yoğunluklarda” bir peaklist yoğunluklarda (Şekil 5) ile spektrum için oluşturmak için. Bu zirve liste konum bilgileri saklı tepe listeden üzerinde taşıyacak. Tepe listeleri farklı DataSet’lerdeki bir elektronik tablo veya diğer matematiksel program analiz için “Export” fonksiyonunu seçerek dışa aktarın. En yüksek yoğunluklarda ile “zirve şiddeti karmaşık spektrum/en yüksek yoğunluk protein spektrumda” her zirve için görev değişikliği hesaplar. Değerleri yüzdesini değiştirmek için 100 çarpma tarafından dönüştürülebilir. En yüksek yoğunluklarda birbirine yakın konumlandırılmış tepeler için genellikle yüksek yoğunluklu proteinler için nispeten geniş zirvesinin olduğu gibi ölçmek daha kolay olmakla birlikte en yüksek birimler de yararlıdır unutmayın. 4. MicroScale Thermophoresis (MST) Ligand Protein E-PRD hazırlanması Ligand protein 1 litre 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, gecede 4 ° C’de yavaşça karıştırarak askıya 3,5 kDa mini diyaliz ünitesinde 800 μL kadar dialyzing tarafından bir MST uyumlu arabelleğe değişimi. Santrifüj Ultrafiltrasyon ünitesi (3 kDa MWCO) kullanarak ligand 14 000 x g 10 dk. temiz bir tüp yoğun protein aktarmak için de centrifuging konsantre ol. Ligand 21.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant zarlarını protein var kaldırmak için yeni bir tüp için transfer. 280 absorbans kullanarak ligand konsantrasyonu belirlemek nm ve ligand tükenme katsayısı. % 10 Ekle %0,015 son bir konsantrasyon vermek için ara-20. Ara-20 adsorpsiyon için kılcal damarlar önlemek için tahlil tampon eklenir. MST deneyler için kullanılan son tahlil arabellek 20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM NaCl, %0,015 olan ara-20. Hedef boya etiketli Protein VimRod hazırlanması Kırmızı-tris-NTA boya PBS-T kırmızı-tris-5 mikron bir konsantrasyon vermek NTA ile sağlanan 1 x 50 μL ekleyerek yeniden oluşturma. 2 μL aliquots 200 μL tüpler içine dağıtmak ve -20 ° C’de depolayın Hedef protein 0,34 mikron ile tahlil arabellek için sulandırmak. Hedef 58 μL kırmızı-tris-NTA boya için bir 2 μL aliquot ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. Nihai hedef boya etiketli 0,33 mikron bölgedir. 21.000 x g 10 min için etiketli hedefe santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant herhangi bir çökelti kaldırmak için yeni bir tüp için transfer. Kırmızı-tris-NTA boya proteinler His6 etiketi ile bağlar ve sub-nanomolar aralığında bir bağlama ayrışma sabiti (KD) vardır. % 100 etkili olduğunu daha fazla hiçbir arıtma gereklidir hedef protein bağlı. MST araç üzerinde açmak ve kontrol yazılımı açın. Kırmızı-tris-NTA boya için kırmızı ayarı seçin. 25 ° c sıcaklık kontrolü açmak Hedefi etiketleme doğrulamak için öntest seçin ve toplama veya cuvettes adsorpsiyon için. Bu parametreler bir değerlendirmesini otomatik olarak sağlanır. Mix 17 μL tahlil arabellek ve hedef protein ve pipetting tarafından mix 3 μL. Onları seyreltilmiş hedef daldırma ve kılcal ortasına kadar sıvı çizim tarafından iki standart kılcal doldurun. Kılcal damarlar içinde belgili tanımlık tepsi ve aletleri içine yerleştirin. Ölçüm başlatın. Floresans yeterli bir düzeyde ve adsorpsiyon (kılcal çizgi şeklinde bozulma) belirtisi yok arıyorum sonuçları gözden geçirin ya da yazılım analizde işaretlenir toplama (distorsiyonları MST izleme). Eğer sonuçları olumlu hareket üstünde-e doğru ligand adımları olmasa bile farklı bir arabellek güvenilir gerekir ya da % 0.05 veya daha fazla ara-20 miktarı artırılabilir. E-PRD Ligand iki kat seyreltme serisi hazırlanması Seyreltme serisi 16, etiketleme tarafından hazırlayın 200 μL Tüpler 1-16. Ligand 17 μL 1.17 Tube1 için istenen en fazla ligand konsantrasyonu daha daha büyük konsantrasyon x ekleyin. Bir aliquot sonra serideki sonraki tüp transfer edileceği gibi bu iki kez gerekli miktar (8,5 μL) birimdir. Testin son hacim 10 μL ligand 1.17 x konsantrasyon 8,5 μL için 1 x 1.5 μL hedef protein, VimRod eklenmesi ile seyreltilmiş yüzden. Bu maksimum konsantrasyon seçilmiş en az 20 kez tahmini KD değeri olmalıdır. Tahlil arabellek 8,5 μL Tubes2-16 her aliquot için yeni bir pipet ucu kullanarak ekleyin. Pipet ipuçları yeniden kullanma (için doğru pipetting bkz: üreticinin talimatlarına tavsiyeler) doğruluğu etkiler. Yavaş yavaş çözüm kabarcıkları oluşmadan tahlil ara belleğe serbest Tube2 ligand Tube1 üzerinden 8,5 μL aktarın. Ligand ve tampon yukarı ve aşağı en az 6 kez, tekrar kabarcıkları oluşmadan pipetting tarafından karıştırın. En yoğun tüp E-PRD 1.5 mM ve etiketli VimRod mevcut bir son konsantrasyonu 50 nM. Ligand 8,5 μL Tube3 için Tube2 aktarım ve tahlil arabellek ile karıştırın. Tüm tüpler ligand eklendi oldu kadar seri seyreltme yineleyin. Böylece tüm tüpler 8,5 μL ligand iki kat dilutions bir dizi içeren Tube16 üzerinden 8,5 μL atmak. Bağlama tepki ve MST deneme hazırlanması Etiketli hedef protein 1.5 μL her tüplerinin ekleyin ve karışımı yavaşça kabarcıklar önlemek için dikkatli olmak yukarı ve aşağı pipetting. 15 dakikadır kuluçkaya. Bağlama tahlil için uzman modu seçin ve seri seyreltme serisi için parametreleri girin. Sıcaklık kontrolü ayarlandığından emin olun için 25 ° C, % 40 ve orta MST iktidara uyarma güç ayarlanır. Bu parametreler okudu diğer bağlama ortakları için optimize edilmiş olması gerekir. Kılcal bağlama reaksiyonlar ile doldurun ve kapiller tepsisine yerleştirin. Alet belgili tanımlık tepsi yük, sıcaklık 25 ° C yeniden elde etmek ve ölçüm başlatmak bekleyin. Veri Analizi Benzeşme analiz yazılımı içinde bağlama tahlil dosyasını açın. Kapiller taramaları gözden geçirin; Floresans düzeyleri ortalama üzerinden % 10’den fazla farklılık değil, hiçbir toplama veya adsorpsiyon 3.6 bölümünde açıklandığı gibi tespit edilmelidir. MST analiz sağ panosunda seçin ve tahlil veri çözümlemesi kümesi sürükleyin. Aynı koşullar altında aynı hedef-ligand bağlayıcı testin birden çok çalıştırma varsa aynı kümesinde bırakarak birleştirilebilir. Alternatif olarak, her çalışma çözümleme bağımsız olarak kesilmesine. Verileri grafik için doz yanıt uygun sekmeye taşıyın. Bir tek bağlama site bekleniyor KD modeli seçin. Hill modeli aynı zamanda kooperatif davranışı ile birden çok bağlayıcı siteleri için bir seçenektir. Kalite kontrol geçemedi aykırı puan uygun-ebilmek var olmak çıkarmak bu aşamada. Birden çok deneyleri ile birleştirme ayarlar ortalama ve standart sapma hataları hesaplanan. Açık belgili tanımlık son etiket ve tek bir grafikte tüm araziler arasında karşılaştırılması. Her eğrinin için uygun sonuçlar oluşturulur tablosundan al. Veri veya monte eğrileri diğer sunu veya analiz yazılımı için istenirse verin.