T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR
Summary
T7 bakteriyofaj numaralandırmak için bir tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli kantitatif PCR (qPCR) yöntemi burada açıklanmıştır. Protokol açıkça fajının genomik DNA hazırlık, PCR reaksiyon hazırlama, qPCR Bisiklet koşullarını ve qPCR veri analizi açıklar.
Abstract
Bu iletişim kuralı T7 phages fajının seçimi deneyler (Yani, “biopanning”) üzerinden Numaralandırılacak kantitatif PCR (qPCR) kullanımını açıklar. qPCR DNA ölçmek için bir floresan tabanlı yaklaşımdır ve faj parçacıklar için bir proxy olarak faj genleri ölçmek için adapte işte. Bu protokol için yüksek sıcaklık ısıtma olmadan ek DNA arıtma kullanılarak facile faj DNA hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Yöntemin yalnızca küçük hacimli ısı phages ve küçük hacimli qPCR tepki gerekir. qPCR yüksek üretilen iş ve hızlı, işlemek ve diğer fajının numaralandırma yaklaşımlar 2 – 4 h. ile karşılaştırıldığında tepkileri bir 96-şey tabak veri almak mümkün, qPCR daha zaman verimli olur. Burada, qPCR biopanning karşı vitro kistik fibrozis gibi mukus modeli üzerinden tespit T7 phages numaralandırmak için kullanılır. QPCR yöntemi T7 phages biopanning diğer türleri dahil olmak üzere diğer deneyler üzerinden ölçmek için genişletilebilir (e.g., protein bağlayıcı, içinde vivo immobilize fajının tarama) ve diğer kaynaklar (Örneğin, su sistemleri veya vücut sıvıları). Özet olarak, herhangi bir DNA kapsüllenmiş virüs ölçmek için bu iletişim kuralı değiştirilebilir.
Introduction
Bakteriyofaj (fajının) ekran teknolojisi, George Smith tarafından 1985 yılında geliştirilen peptid veya protein ligandlar hedefleri veya reseptörleri hücre zarı, hastalık antijenleri, hücre organelleri veya özel karşı tanımlamak için güçlü, yüksek-den geçerek bir yaklaşım olduğunu organ ve dokulara son yirmi yılda1,2. Burada, rasgele kütüphanelerin polipeptitler veya tek zincir antikorlar phages (genellikle M13 veya T7) kat protein üzerinde görüntülenir ve belirli ligandlar immobilize proteinler vitro veya içinde vivo karşı kaydırma tespit edilmesi Biyolojik sistemlerde bir yinelemeli seçim sürecinde. O zaman, ligandlar tanı ve tedavi hastalıkları3,4için görüntüleme veya terapötik ajanlar ile birleştiğinde olabilir. Doğru bir şekilde phages biopanning birden çok adımı sırasında numaralandırmak için önemlidir: (1) substrat için bağlamak phages ölçmek için ve (2) her turda seçim ile zenginleştirme olup olmadığını belirlemek için phages ölçmek için (fajının zenginleştirme gösterir biopanned Feyc benzeşme hedef için). Miktar, Çift katmanlı plak yöntemi, geçerli altın standart birden çok zorluklar sunar; sıkıcı, hantal ve potansiyel olarak çok sayıda örnekleri için yanlış olduğunu. Bu nedenle, bizim grup M13 ve T7 fajının parçacıklar biopanning5numaralandırmak için bir hassas, tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yöntemi geliştirmiştir.
qPCR doğru bir şekilde T7 ve M13 phages ölçmek için cazip ve uygun bir yöntemdir. Her bireysel fajının parçacık yalnızca genomik DNA (dsDNA veya ssDNA) bir kopyasını içerebilir yana bir fajının genom bir fajının parçacık için eşdeğerdir; Feyc genleri sayısı miktarının tarafından phages sayısını ölçmek mümkün olabilir. QPCR, floresan muhabir sırasında boyalar özel olarak sigara fajının genomik DNA bağlamak veya özellikle fingerprinting astar PCR güçlendirme sırasında ve floresan sinyal güçlendirme her turu ile artar. Floresans sinyal bu yuvarlak/amplifikasyon döngüsü eşik ulaştığında eşik döngüsü (Ct) belirtilmektedir. Başvuru faj DNA bilinen konsantrasyonları standart bir eğri oluşturmak için Ct değerlerine karşı çizilir. Standart eğri DNA örnekleri Ct değerleri ile kullanarak, phages konsantrasyonları değiştirilmiş.
Çok sayıda stratejileri daha önce geliştirilen ve yoğun phages biopanning üzerinden ölçmek için kullanılan iken, her biri belirli zorlukları vardır. En popüler ve geleneksel yöntem çift-tabaka plak tahlil olduğunu. Burada, bakteri seri dilutions hazırlanan phages ile enfekte, solid agar substrat kaplama ve agar ile overlaid ana bilgisayar; phages oluşan plaklar (Yani, plak oluşturan birimler veya pfu) agar plaka numarası ile numaralandırılır. Plak tahlil hassas ama sıkıcı, zaman alıcı ve yanlış, özellikle çok sayıda örnekleri ve yüksek konsantrasyonları5. Ayrıca, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISA) M13 T7 fajının parçacıklar6,7,ve8numaralandırmak için adapte edilmiştir. Burada, farklı dilutions, phages bağlı olan ve bir katı substrat (Yani, bir Mikroplaka) yakalanan, fajının özel antikorlar ile probed ve gazetecilere (Örneğin, enzim hassas chromogenic yüzeylerde, fluorophores) kullanarak tespit Feyc parçacıklar mevcut sayısını belirleyin. Veriler (Örneğin, floresan, absorbans) örneklerinin fajının standartları bilinen konsantrasyonlarda karşı bilinmeyen konsantrasyonları ölçmek için kullanılabilir. Farklı fajının tabanlı ELISAs geliştirilmiştir ancak potansiyel kısıtlamalar bulunmaktadır. Bir grubu bir kağıda dayalı sandviç ELISA yedi büyüklük (102-109 pfu/mL); yayılmış bir miktar aralığı ile geliştirilen Ancak, bu yöntem birden çok adımı antikor kaplama gerekli ve tahlil8için tüm günümü aldı. Grubumuz aynı zamanda M13 fajının parçacıklar ölçmek için bir ELISA yöntemi geliştirilmiş ancak 10 daha az duyarlı algılama aralığı vardı6 ‘ 1011 pfu/mL5. Değiştirilebilir lanthanide floresan problar M13 numaralandırmak için geliştirilmiştir ve miktar veri içinde 20 dk alınamadı; Ancak, bu tahlil vardır dar bir Dinamik Aralık 10 1012 pfu/mL99 . Bir grup atomik kuvvet mikroskobu M13 fajının parçacıklar çözüm numaralandırmak için kullanılan, ama bu gelişmiş elektron mikroskobu gerektirir ve sadece konsantrasyonları10dar bir Aralık içinde çalıştı. Başka bir çalışmada monodisperse emülsiyonlar floresan M13 ve T4 muhabir phages tuzak ve floresan damlacıkları tarafından phages saymak için kullanılır; Ancak, bu yaklaşım aynı zamanda bir dar miktar aralığı 10 sergilenen2 106 pfu/mL11. Damlacık dijital PCR M13 phages ölçmek için kullanılan, bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan fajının parçacıklar12sayısı arasında ayırt etmek bu yaklaşım değiştiremiyor.
Bizim grup yakın zamanda T7 ve M13 phages biopanning iki farklı floresan muhabir boyalar5kullanarak bir kan – beyin bariyerini hücre modeli üzerinden tespit numaralandırmak için qPCR yöntemleri geliştirmiştir. Söz konusu miktar yöntemlerine göre geliştirdiğimiz qPCR yöntemleri yüksek üretilen iş ve zaman tasarruflu çok sayıda örnekleri ölçmek için ve mümkün ayırt arasında bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan phages DNaz ile ben, ön arıtma Feyc örnekleri. Önemlisi, bu yaklaşımın M13 ve T7 bacteriophages biopanning örneklerinden tekrarlanarak ve doğru bir şekilde ölçmek. Acemi araştırmacılar fajının qPCR alanında rehberlik için burada T7 fajının parçacıkları bir sistein kýsýtlanmýþ kitaplığı (CX7C) karşı bir vitro kistik fibrozis (CF) mukus bariyer panned numaralandırmak için detaylı qPCR yöntemi açıklanmaktadır. Bu işten qPCR yöntemi fajının parçacıklar biopanning diğer türlerinden ve su, toprak ve vücut sıvıları gibi diğer kaynaklardan ölçmek için genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
QPCR yöntemleri fajının genomik DNA5ölçmek için geliştirdiğimiz ve burada açıkladığımız ve T7 phages karşı bir CF benzeri mukus bariyer seçili numaralandırmak için qPCR yöntemini benimsemiştir. Yayın, nicel gerçek zamanlı PCR deneyler (MIQE) yönergeleri için en az bilgiyi geliştirmek ve numaralandırma T7 phages15qPCR yöntemini doğrulamak için adapte. Phages biopanning deneyler üzerinden ölçmek için geliştirilmiş zaman verimli, güvenilir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser ilaç Vakfı araştırma Starter hibe tarafından desteklenen ve ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R01HL138251 altında verin.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
References
- Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
- Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).
- Dias-Neto, E., et al. Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis. PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).
- Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR. Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).
- Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).
- Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage. Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).
- Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR. J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).
- Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes. BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).
- Schlaman, H. R. M., et al. Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).
- Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions. Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).
- Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).
- . T7Select® Biopanning Kit Available from: https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit (2018)
- Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. Linear Regression Analysis. Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).
- Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Fittipaldi, M., et al. Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR. Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).
- Lodder, W. J., et al. Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR. Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).
- Brown-Jaque, M., et al. Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates. International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).
- Naveca, F. G., et al. Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).
- Jia, J., et al. Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR. Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).
- Bliem, R., et al. A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).
- Wan, Z., Goddard, N. L. Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study. G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).
