PCR quantitativo do bacteriófago T7 de Biopanning

Tecnologia de exibição do bacteriófago (fago), desenvolvida por George Smith em 1985, é uma abordagem poderosa, elevado-throughput para identificar peptídeos ou proteínas ligantes contra alvos ou receptores da membrana celular, organelas celulares, antígenos da doença ou específicos órgãos e tecidos nas últimas duas décadas^1,2. Aqui, bibliotecas aleatórias de polipeptídeos ou anticorpos de cadeia única são exibidas sobre as proteínas do casaco do fago (tipicamente M13 ou T7) e ligantes específicos podem ser identificados de garimpar contra proteínas imobilizadas em vitro ou in vivo sistemas biológicos, através de um processo de seleção iterativa. Então, ligantes podem ser acoplados com agentes terapêuticos ou de imagem para diagnóstico e tratamento de doenças^3,4. É fundamental para enumerar com precisão o fago durante várias etapas de biopanning: (1) para quantificar o fago que ligam-se ao substrato e (2) para quantificar o fago para determinar se há enriquecimento com cada rodada de seleção (enriquecimento do fago indica biopanned afinidade do fago para o destino). O atual padrão de ouro para quantificação, ensaio de chapa de dupla camada, apresenta vários desafios; é tedioso, complexos e potencialmente impreciso para um grande número de amostras. Portanto, nosso grupo desenvolveu um método de (qPCR) reação em cadeia de polimerase quantitativo sensível, reprodutível, precisos e tempo-eficiente para enumerar as partículas do fago M13 e T7 de biopanning⁵.

qPCR é um método atraente e viável quantificar com precisão o fago T7 e M13. Desde que cada partícula individual do fago pode conter apenas uma cópia do DNA genômico (dsDNA ou ssDNA), um genoma do fago é equivalente a uma partícula fago; quantificando o número de genomas do fago, é possível quantificar o número de fago. Durante qPCR, repórter fluorescente corantes ligam o DNA genômico do fago não especìfica ou especificamente por meio de cartilhas específicas durante a amplificação por PCR e a fluorescência sinal aumenta com cada rodada de amplificação. Quando o sinal de fluorescência atinge o limite, que rodada/ciclo da amplificação é conhecido como o ciclo de limiar (Ct). As concentrações conhecidas de referência do fago DNA são plotadas contra seus valores de Ct para estabelecer uma curva padrão. Usando a curva padrão com os valores de Ct de amostras de DNA, as concentrações do fago podem ser interpoladas.

Enquanto inúmeras estratégias foram anteriormente desenvolvidas e usadas extensivamente para quantificar o fago de biopanning, cada um deles tem desafios específicos. O método mais popular e convencional é o ensaio da chapa de dupla camada. Aqui, o anfitrião bactérias estão infectadas com fago preparado em diluições em série, são banhadas em um substrato sólido ágar e são revestidas com ágar; fagos são enumerados com o número de placas formado (ou seja, placa formando unidades ou pfu) na placa de ágar. Ensaio de placa é sensível mas tedioso, demorado e impreciso, especialmente para numerosas amostras e com altas concentrações de⁵. Além disso, ensaios imunoenzimático (ELISA) foram adaptados para enumerar M13 e T7 fago partículas^6,7,8. Aqui, o fago em diferentes diluições é vinculado e capturado em um substrato sólido (ou seja, uma microplaca), sondado com anticorpos específicos do fago e detectados por meio de repórteres (por exemplo, enzima sensível cromogênico substratos, fluorophores) para Determine o número de partículas do fago presentes. As leituras (por exemplo, fluorescência, absorbância) das amostras podem ser usadas para quantificar as concentrações desconhecidas contra normas do fago em concentrações conhecidas. Diferentes baseados no fago ELISAs têm sido desenvolvidas, mas têm limitações potenciais. Um grupo desenvolveu um sanduíche em papel ELISA com uma gama de quantificação que durou sete ordens de magnitude (10²-10⁹ pfu/mL); no entanto, esse método necessárias várias etapas de revestimento de anticorpo e levou para um dia inteiro para o ensaio de⁸. Nosso grupo também desenvolveu um método de ELISA para quantificar as partículas de fago M13, mas tinha um intervalo de detecção menos sensível do 10⁶ a de pfu/mL 10^{11 5}. Lantanídios comutável sondas de fluorescência foram desenvolvidas para enumerar M13 e dados de quantificação podem ser obtidos dentro de 20 min; no entanto, este ensaio tem uma estreita faixa dinâmica de 10⁹ 10¹² pfu/mL⁹. Um grupo usado microscopia de força atômica para enumerar as partículas de fago M13 em solução, mas isso requer avançados de microscopia eletrônica e trabalhou apenas dentro de uma faixa estreita de concentrações¹⁰. Outro estudo usado monodisperso emulsões para prender fluorescente fago M13 e T4 do repórter e contar fago pelo número de gotículas fluorescentes; no entanto, esta abordagem também exibiu uma gama estreita de quantificação de 10² a 10 de pfu/mL^{6 11}. Enquanto gotículas que digital PCR tem sido utilizada para quantificar o fago M13, esta abordagem é incapaz de diferenciar entre o número de partículas de fago infecciosas e não infecciosas¹².

O nosso grupo desenvolveu recentemente qPCR métodos para enumerar fago T7 e M13 identificado de biopanning contra um modelo de célula barreira sangue – cérebro usando dois diferentes repórter fluorescente tinturas⁵. Em comparação com métodos de quantificação acima mencionados, os métodos de qPCR desenvolvemos foram elevado-throughput e tempo-eficiente para quantificar numerosas amostras e capaz de diferenciar entre fago infeccioso e não infecciosas com DNase eu pré-tratamento da amostras do fago. Importante, esta abordagem pode reproducibly e precisão quantificar bacteriófagos M13 e T7 de biopanning amostras. Para orientar pesquisadores novatos na área do fago qPCR, aqui descrevemos um método de qPCR detalhadas para enumerar as partículas do fago T7 de uma biblioteca de cisteína-restrita (CX7C) garimpadas contra uma barreira de muco de fibrose cística (CF) em vitro . Partir deste trabalho, método de qPCR pode ser estendido para quantificar as partículas do fago de outros tipos de biopanning e de outras fontes, incluindo água, solo e fluidos corporais.