PCR cuantitativa de bacteriófago T7 de Biopanning

Tecnología de visualización de bacteriófagos (fagos), desarrollada por George Smith en 1985, es un enfoque potente y alto rendimiento para identificar péptidos o proteínas ligandos contra objetivos o receptores de la membrana celular, antígenos de la enfermedad, organelos celulares o específicos órganos y tejidos en los últimos dos décadas^1,2. Aquí, al azar bibliotecas de polipéptidos o anticuerpos de cadena simple se muestran en las proteínas de la capa de phages (típicamente M13 o T7) y ligandos específicos pueden ser identificados de bateo contra proteínas inmovilizadas en vitro o en vivo sistemas biológicos a través de un proceso iterativo de selección. Entonces, los ligandos pueden ser juntados con agentes terapéuticos o proyección de imagen para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades^3,4. Es importante enumerar con precisión los phages durante varios pasos de biopanning: (1) cuantificar fagos que se unen al sustrato y (2) cuantificar los phages para determinar si hay enriquecimiento con cada ronda de selección (enriquecimiento phage indica biopanned afinidad de fagos para el destino). El estándar de oro actual para la cuantificación, ensayo de placa de doble capa, presenta múltiples desafíos; es tedioso, engorroso y potencialmente inexacto para un gran número de muestras. Por lo tanto, nuestro grupo ha desarrollado un método de (qPCR) la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa sensible, reproducible, precisa y eficiente para enumerar las partículas de fago M13 y T7 de biopanning⁵.

qPCR es un método atractivo y factible de cuantificar con precisión fagos T7 y M13. Puesto que cada partícula de fago individual sólo puede contener una copia de la DNA genomic (dsDNA o ssDNA), un genoma phage es equivalente a una partícula de fago; al cuantificar el número de genomas de fagos, es posible cuantificar el número de fagos. Durante qPCR, reportero fluorescente tintes atan phage de la DNA genomic no específicamente o específicamente a través de cebadores específicos de secuencia durante la amplificación por PCR y la fluorescencia señal aumenta con cada ronda de amplificación. Cuando la señal de fluorescencia alcanza el umbral, que ronda/ciclo de amplificación se observa como el ciclo umbral (Ct). Las concentraciones conocidas de fago ADN de referencia se trazan contra sus valores de Ct para establecer una curva estándar. Usando la curva estándar con los valores de Ct de muestras de ADN, las concentraciones de fagos pueden ser interpoladas.

Mientras que numerosas estrategias han sido previamente desarrollados y ampliamente utilizado para cuantificar los phages de biopanning, cada uno de ellos tiene retos específicos. El método más popular y convencional es el ensayo de placa de doble capa. Aquí, host bacterias infectan con phages preparados en diluciones seriadas, se platean en un sustrato de agar sólido y son overlaid con agar; los phages son enumerados con el número de las placas formadas (es decir, unidades formadoras de placa o pfu) en la placa de agar. Ensayo de placa es sensible pero tedioso, lento e inexacto, especialmente para muestras numerosas y con altas concentraciones de⁵. Además, los análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) han sido adaptados para enumerar M13 y T7 fagos partículas^6,7,8. Aquí, están obligados los phages en diferentes diluciones y capturado en un sustrato sólido (es decir, una microplaca), sondeado con anticuerpos específicos del fago y detectado usando Reporteros (p. ej., enzimas sustratos cromogénicos sensible, fluoróforos) para determinar el número de partículas de fago presente. Las lecturas (por ejemplo, fluorescencia, absorbancia) de muestras pueden utilizarse para cuantificar las concentraciones desconocidas contra estándares de fago en concentraciones conocidas. Se han desarrollado ELISAs basados en fagos diferentes pero tienen limitaciones potenciales. Un grupo desarrolló un sándwich en papel ELISA con un rango de cuantificación que abarcó siete órdenes de magnitud (10²-10⁹ pfu/mL); sin embargo, este método requiere varios pasos de la capa de anticuerpo y tomó hasta un día entero para el ensayo⁸. Nuestro grupo también desarrolló un método de ELISA para cuantificar las partículas de fago M13 pero tenía un alcance de detección menos sensible de 10⁶  10¹¹ pfu/mL⁵. Han desarrollado sondas de fluorescencia de lantánido conmutable para enumerar M13 y podrían obtenerse datos de cuantificación dentro de 20 minutos; sin embargo, este ensayo tiene un rango dinámico estrecho de 10⁹ 10¹² pfu/mL⁹. Un grupo utilizó microscopía de fuerza atómica enumerar las partículas de fago M13 en solución, pero esto requiere microscopia electrónica avanzada y sólo trabajó dentro de un estrecho rango de concentraciones¹⁰. Otro estudio utilizado emulsiones monodispersa phages de reportero fluorescentes M13 y T4 y phages de la cuenta por el número de gotas fluorescentes; sin embargo, este enfoque también exhibió una gama estrecha de la cuantificación de 10² 10⁶ pfu/mL¹¹. Mientras gota que PCR digital se ha utilizado para cuantificar los phages M13, este enfoque es incapaz de distinguir entre el número de partículas de fago infecciosas y no infecciosas¹².

Nuestro grupo ha desarrollado métodos de qPCR para enumerar fagos T7 y M13 identificadas biopanning contra un modelo de celular de la barrera blood – brain con dos diferentes reportero fluorescente tintes⁵. Comparado con métodos de cuantificación ya mencionado, los métodos de qPCR desarrollamos fueron alto rendimiento y tiempo-eficiente para cuantificar muestras numerosas y capaces de diferenciar entre phages infecciosos y no infecciosas con DNasa I tratamiento previo de la muestras de fago. Lo importante, este enfoque puede reproducible y precisa cuantificar bacteriófagos M13 y T7 de muestras biopanning. Para guiar a los investigadores noveles en el área de qPCR de fago, aquí se describe un método detallado de qPCR para enumerar las partículas de fago T7 en una biblioteca con restricciones de cisteína (CX7C) panorámica contra una barrera de moco en vitro la fibrosis quística (FQ). De este trabajo, método de qPCR puede ampliarse para cuantificar las partículas de fago de otros tipos de biopanning y de otras fuentes, incluyendo agua, suelo y fluidos corporales.