Quantitative PCR von Bakteriophagen T7 aus Biopanning

Bakteriophagen (Phagen)-Display-Technologie, entwickelt von George Smith 1985 ist ein leistungsfähiges, Hochdurchsatz-Ansatz Peptid oder Protein Liganden gegen Ziele oder Rezeptoren von der Zellmembran, Krankheit Antigene, zellulare Organellen oder spezifische identifizieren Organe und Gewebe in den vergangenen zwei Jahrzehnten^1,2. Hier zufällige Bibliotheken der Polypeptide oder einzelne Kette Antikörper auf die Hüllproteine des Phagen (in der Regel M13 oder T7) angezeigt werden, und spezifische Liganden identifiziert werden, von panning gegen immobilisierten Proteine in Vitro oder in vivo biologischen Systemen durch einen iterativen Auswahlprozess. Dann können die Liganden mit bildgebenden oder therapeutischen Wirkstoffen für Diagnose und Behandlung von Krankheiten^3,4gekoppelt werden. Ist es wichtig, genau Auflisten von Phagen in mehrere Stufen der Biopanning: (1), Phagen zu quantifizieren, die an das Substrat gebunden und (2) zu quantifizieren Phagen um festzustellen, ob Anreicherung mit jeder Runde Auswahl (Phagen Anreicherung zeigt Biopanned Phagen-Affinität für das Ziel). Der derzeitige Goldstandard für Quantifizierung, Doppelschicht-Plaque-Assay, Herausforderungen mehrere; Es ist langwierig, umständlich und möglicherweise ungenau für eine große Anzahl von Proben. Daher hat unsere Fraktion eine sensible, reproduzierbare, präzise und zeitsparend quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) Methode, um M13 und T7 Phagen Partikel aus Biopanning⁵aufzählen entwickelt.

qPCR ist eine attraktive und machbare Methode, T7 und M13 Phagen genau zu quantifizieren. Da jedes einzelnen Phagen Partikel nur eine Kopie der genomischen DNA (DsDNA oder SsDNA) enthalten kann, entspricht einem Phagen-Genom ein Phagen Partikel; durch die Zahl der Phagen Genome zu quantifizieren, ist es möglich, die Zahl der Phagen zu quantifizieren. Während qPCR, fluoreszierende Reporter Farbstoffe binden Phagen genomischer DNA unspezifisch oder speziell durch Sequenz-spezifische Primer während PCR Verstärkung und die Fluoreszenz Signal erhöht sich mit jeder Runde der Verstärkung. Wenn das Fluoreszenzsignal erreicht die Schwelle, die Runde/Zyklus der Verstärkung wird als der Schwellenwert-Zyklus (Ct) vermerkt. Die bekannten Konzentrationen von Referenz-Phagen DNA werden gegen ihre Ct-Werte herstellen eine Standardkurve geplottet. Mit der Ct-Werte von DNA-Proben der Standardkurve, können die Konzentrationen von Phagen interpoliert werden.

Während zahlreiche Strategien wurden zuvor entwickelt und intensiv genutzt, um Phagen aus Biopanning zu quantifizieren, hat jeder von ihnen spezifischen Herausforderungen. Die beliebtesten und konventionelle Methode ist Doppelschicht-Plaque-Assay. Hier, Host Bakterien mit Phagen vorbereitet in Verdünnungsreihen infiziert sind, sind auf einem festen Nährboden Substrat beschichtet und werden mit Agar überlagert; Phagen sind mit der Anzahl von Plaques gebildet (d. h. Plaque bildende Einheiten oder Pfu) auf der Agarplatte aufgezählt. Plaque-Assay ist sensibel aber mühsam, zeitaufwendig und ungenau, vor allem für zahlreiche Proben und mit hohen Konzentrationen⁵. Darüber hinaus wurden Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) M13 und T7 Phagen Partikel^6,7,8aufzählen angepasst. Hier werden Phagen bei verschiedenen Verdünnungen gebunden und auf ein festes Substrat (d. h. einer Mikrotestplatte) gebannt, sondiert mit Phagen-spezifische Antikörper und mithilfe von Reportern (z. B. Enzym empfindliche chromogene Substrate, Fluorophore) erkannt bestimmen Sie die Anzahl der Phagen Partikel vorhanden. Die anzeigen (z. B. Fluoreszenz, Absorption) der Proben können verwendet werden, zu unbekannte Konzentrationen gegen Phagen Standards bei bekannten Konzentrationen zu quantifizieren. Verschiedenen Phagen-basierte ELISAs entwickelt worden, aber sie haben mögliche Einschränkungen. Eine Gruppe entwickelte eine Papier-basierten Sandwich ELISA mit einer Quantifizierung-Palette, die überspannte sieben Größenordnungen (10²-10⁹ Pfu/mL); jedoch diese Methode erforderte mehrere Schritte der Antikörper-Beschichtung und dauerte bis einen ganzen Tag für den Assay-⁸. Unsere Fraktion auch entwickelt eine ELISA-Methode zur Quantifizierung der M13 Phagen Partikel aber hatte ein unempfindlicher Erfassungsbereich 10⁶ bis 10¹¹ Pfu/mL⁵. Schaltbare lanthanid Fluoreszenz Sonden wurden entwickelt, um M13 aufzählen und Quantifizierung Daten innerhalb von 20 min gewonnen werden; Dieser Test hat jedoch einen engen Dynamikbereich von 10⁹ 10¹² Pfu/mL⁹. Eine Gruppe verwendet Rasterkraftmikroskopie M13 Phagen Partikel in Lösung aufzählen, aber dies erfordert erweiterte Elektronenmikroskopie und funktionierte nur in einem engen Bereich von Konzentrationen¹⁰. Eine weitere Studie zur trap fluoreszierender M13 und T4 Reporter Phagen und Phagen zählen, indem Sie die Anzahl der fluoreszierenden Tröpfchen Monodisperse Emulsionen; jedoch stellte dieser Ansatz auch eine schmale Quantifizierung reichen von 10² bis 10⁶ Pfu/mL¹¹. Während Tröpfchen, die digitale PCR verwendet wurde, um M13 Phagen zu quantifizieren, ist dieser Ansatz nicht in der Lage, zwischen der Anzahl der infektiösen und nicht infektiösen Phagen Partikel¹²zu unterscheiden.

Unsere Gruppe hat vor kurzem qPCR Methoden zum Auflisten von T7 und M13 Phagen aus Biopanning gegen ein Blut – Hirn-Schranke-Zelle-Modell mit zwei verschiedenen fluoreszierenden Reporter Farbstoffe⁵identifiziert entwickelt. Im Vergleich zu oben genannten Quantifizierungsmethoden, qPCR-Methoden, die wir entwickelt wurden Hochdurchsatz- und zeiteffizient zu zahlreichen Proben zu quantifizieren und in der Lage zu differenzieren zwischen infektiösen und nicht infektiösen Phagen mit DNase ich Vorbehandlung von der Phagen Proben. Wichtig ist, kann dieser Ansatz reproduzierbar und präzise M13 und T7 Bakteriophagen von Biopanning Proben quantifizieren. Um Anfänger Forscher auf dem Gebiet des Phagen qPCR zu leiten, beschreiben wir hier eine detaillierte qPCR-Methode, um T7 Phagen Partikel aus einer Cystein eingeschränkt Bibliothek (CX7C) gegen eine in-vitro- zystische Fibrose (CF) Schleim Barriere verrissen aufzählen. Aus dieser Arbeit kann qPCR-Methode erweitert werden um Phagen Partikel aus anderen Arten von Biopanning und aus anderen Quellen, einschließlich Wasser, Boden und Körperflüssigkeiten zu quantifizieren.