Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning

Bacteriofaag (faag) display technologie, ontwikkeld door George Smith in 1985, is een krachtige, high-throughput benadering te identificeren van peptide of de proteïne liganden tegen doelstellingen of receptoren van het celmembraan, ziekte antigenen, cellulaire organellen of specifiek organen en weefsels in de afgelopen twee decennia^1,2. Hier, willekeurige bibliotheken van polypeptiden of één keten antilichamen worden weergegeven op de vacht eiwitten van bacteriofagen (meestal M13 of T7), en specifieke liganden kunnen worden geïdentificeerd van pannen tegen geïmmobiliseerdet eiwitten in vitro of in vivo biologische systemen via een iteratieve selectietraject. Vervolgens kunnen liganden gepaard gaan met imaging of therapeutische agenten voor diagnose en behandeling van ziekten^3,4. Het is van cruciaal belang om op te sommen nauwkeurig bacteriofagen tijdens meerdere stappen van biopanning: (1) te kwantificeren bacteriofagen die zich aan het substraat binden en (2) te kwantificeren bacteriofagen om te bepalen of er verrijking met elke ronde van de selectie (bacteriofaag verrijking geeft aan biopanned Phage affiniteit voor de doelgroep). De huidige gouden standaard voor kwantificering, dubbellaags plaque assay, presenteert meerdere uitdagingen; het is vervelend, omslachtige en potentieel onjuist is voor een groot aantal monsters. Daarom heeft onze fractie een gevoelige, reproduceerbaar, nauwkeurige en tijd-efficiënte kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) methode om te inventariseren M13 en T7 phage deeltjes van biopanning⁵ontwikkeld.

qPCR is een aantrekkelijke en haalbare methode om T7 en M13 bacteriofagen nauwkeurig te kwantificeren. Omdat elk deeltje van de individuele faag slechts één exemplaar van genomic DNA (dsDNA of ssDNA) bevatten kan, is een bacteriofaag genoom gelijk aan één phage deeltjes; door het kwantificeren van het aantal faag genomen, is het mogelijk te kwantificeren van het aantal bacteriofagen. Tijdens qPCR, fluorescerende verslaggever kleurstoffen binden genomic DNA van de bacteriofaag niet-specifiek of specifiek door middel van sequentie-specifieke primers tijdens PCR versterking, en de fluorescentie signaal verhoogt met elke ronde voor amplificatie. Wanneer het signaal van de fluorescentie bereikt de drempel, die ronde/cyclus van versterking is bekend als de drempel cyclus (Ct). De bekende concentraties van referentie phage DNA worden uitgezet tegen hun Ct-waarden om een standaard curve. Met behulp van de standaard curve met de Ct-waarden van DNA-monsters, kunnen de concentraties van bacteriofagen worden geïnterpoleerd.

Terwijl talrijke strategieën zijn eerder ontwikkeld en uitgebreid te kwantificeren bacteriofagen van biopanning gebruikt, heeft elk van hen specifieke uitdagingen. De meest populaire en conventionele methode is dubbellaags plaque assay. Hier, host bacteriën geïnfecteerd zijn met bacteriofagen voorbereid op een seriële verdunningen, op een solide agar substraat zijn verguld en zijn bedekt met agar; met het aantal plaques gevormd (dat wil zeggen, plaque vormende eenheden of pfu) op de agarplaat bacteriofagen geïnventariseerd. Plaque assay is gevoelig maar vervelend, tijdrovend en onnauwkeurig, vooral voor talloze voorbeelden en met hoge concentraties⁵. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) zijn bovendien aangepast om op te sommen M13 en T7 phage deeltjes^6,7,8. Hier, bacteriofagen in verschillende verdunningen zijn gebonden en gevangen op een stevige ondergrond (dat wil zeggen, een microplate) gesondeerd met faag-specifieke antilichamen en opgespoord door middel van verslaggevers (bijvoorbeeld enzym gevoelige chromogenic substraten, fluorophores) te Bepaal het aantal phage deeltjes aanwezig. De uitlezingen (b.v., fluorescentie, absorptie) van monsters kunnen te kwantificeren van onbekende concentraties tegen faag normen bij bekende concentraties worden gebruikt. Verschillende faag gebaseerde ELISAs zijn ontwikkeld, maar ze hebben potentiële beperkingen. Een groep ontwikkelde een papieren sandwich-ELISA met een kwantificering bereik dat omvatte zeven ordes van grootte (10²-10⁹ pfu/mL); echter, deze methode vereist meerdere stappen van antilichaam coating, kwam een hele dag voor de test-⁸. Onze fractie ook ontwikkelde een ELISA-methode om te kwantificeren M13 phage deeltjes maar had een minder gevoelige registratiebereik van 10⁶  10¹¹ pfu/mL⁵. Schakelbare lanthanide fluorescentie sondes zijn ontwikkeld om te inventariseren M13 en kwantificering gegevens kunnen worden verkregen binnen 20 min; Deze bepaling heeft echter een smalle dynamisch bereik van 10⁹ tot en met 10¹² pfu/mL⁹. Één groep atomaire kracht microscopie gebruikt om op te sommen M13 phage deeltjes in oplossing, maar dit vereist geavanceerde elektronenmicroscopie en werkte slechts binnen een smalle bandbreedte van concentraties¹⁰. Een andere studie monodispers emulsies gebruikt om val fluorescerende M13 en T4 verslaggever bacteriofagen en bacteriofagen tellen het aantal fluorescerende druppels; echter, deze aanpak ook tentoongesteld een smalle kwantificering variëren van 10² tot en met 10⁶ pfu/mL¹¹. Terwijl de druppel die digitale PCR te kwantificeren M13 bacteriofagen is gebruikt, is deze aanpak kunnen onderscheid maken tussen het aantal infectieuze en niet-infectieuze phage deeltjes¹².

Onze fractie heeft onlangs qPCR methoden voor het inventariseren van de T7 en M13 bacteriofagen geïdentificeerd van biopanning tegen een bloed – hersenbarrière cel model met twee verschillende fluorescente verslaggever kleurstoffen⁵ontwikkeld. In vergelijking met voornoemde kwantificering methoden, de methoden van de qPCR we ontwikkeld waren high-throughput en tijd-efficiënte te kwantificeren van talloze voorbeelden en bekwaam om te onderscheiden tussen infectieuze en niet-infectieuze bacteriofagen met DNase ik voorbehandeling van de Phage monsters. Nog belangrijker is, deze aanpak kan reproducibly en nauwkeurig te kwantificeren M13 en T7 bacteriofagen van biopanning monsters. Begeleiden van beginnende onderzoekers op het gebied van phage qPCR, beschrijven hier we een gedetailleerde qPCR methode om te inventariseren T7 phage deeltjes uit een bibliotheek van cysteïne-beperkt (CX7C) laten draaien tegen een in vitro -barrière van het cystic fibrosis (CF)-slijm. Van dit werk, kan qPCR methode worden uitgebreid om te kwantificeren van phage deeltjes van andere soorten biopanning en uit andere bronnen, met inbegrip van water, bodem en lichaamsvloeistoffen.