Количественная ПЦР бактериофага Т7 от Biopanning

Бактериофага (ФАГ) дисплей технология, разработанная Джордж Смит в 1985 году, представляет собой мощный, высок объём подход к идентификации пептид или белок лигандов против целей или рецепторов клеточной мембраны, болезни антигены, клеточных органелл или конкретных органов и тканей в последние два десятилетия^1,2. Здесь случайные библиотек полипептиды или одной цепи антитела отображаются на пальто белки бактериофаги (обычно M13 или T7), и конкретные лигандов могут быть определены из панорамирование против подвижности белков в vitro или в естественных условиях биологические системы через итеративный отбора. Затем лиганды может быть в сочетании с изображений или терапевтических агентов для диагностики и лечения заболеваний^3,4. Очень важно точно перечислять бактериофаги во время нескольких шагов biopanning: (1) количественно бактериофаги, привязанные к подложке и (2) для количественной оценки бактериофаги, чтобы определить, если есть обогащения с каждом раунде отбора (ФАГ обогащения указывает biopanned Фаговые сродство для целевого объекта). Текущий золотой стандарт для количественной оценки, assay металлической пластинкы-двухслойная, представляет несколько проблем; Это утомительно, громоздкой и потенциально неточным для большого числа проб. Таким образом наша группа разработала чувствительных, воспроизводимость, точной и время эффективных количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) метод для перечисления M13 и Т7 Фаговые частицы от biopanning⁵.

ПЦР является привлекательным и осуществимым методом точного количественного определения T7 и M13 бактериофаги. Поскольку каждый индивидуальный фаговых частиц может содержать только одну копию геномной ДНК (dsDNA или ssDNA), один Фаговые генома эквивалентна одной Фаговые частицы; путем определения количественных показателей числа Фаговые геномов, целесообразно определить количество бактериофаги. Во время ПЦР, флуоресцентный репортер красители привязать геномной ДНК фага неспецифически или специально через последовательность специфические праймеры во время ПЦР-амплификации и флуоресценции сигнала увеличивается с каждым раундом амплификации. Когда сигнал флуоресценции достигает порога, что раунд/цикл амплификации отмечается как порог цикла (Ct). Известной концентрации ссылка Фаговые ДНК заговор против их Ct значения для установления стандартной кривой. Использование стандартной кривой с КТ значения образцов ДНК, может путем интерполяции концентрации бактериофаги.

В то время как ранее разработаны и широко используется для количественного определения бактериофаги от biopanning многочисленные стратегии, каждая из них имеет конкретные проблемы. Метод наиболее популярных и обычных является assay металлической пластинкы двойного слоя. Здесь, принимающей бактерии заражены бактериофаги, подготовленных на серийных разведений, покрытие на подложке твердых агар и обложил с агар; Бактериофаги перечисляются с количество металлических пластинк сформирована (то есть, доска формирования подразделений или ОРП) на табличке агар. Assay металлической пластинкы чувствительных, но утомительный, длительным и неточной, особенно для многочисленных образцов и с высокой концентрации⁵. Кроме того энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) были адаптированы для перечисления M13 и Т7 Фаговые частицы^6,,78. Здесь, связаны бактериофагов в различных разведениях и захвачен на твердом субстрате (т.е., микроплита), исследовали с ФАГ специфические антитела и обнаружить с помощью Репортеры (например, фермент чувствительных хромогенных субстратов, флуорофоров) для Определите количество фаговых частиц настоящего. Надписи (например, флюоресценция, поглощения) образцов может использоваться для количественного определения неизвестных концентрациях против Фаговые стандартов в известных концентрациях. Были разработаны различные ELISAs ФАГ основе, но они имеют потенциальные ограничения. Одна группа разработала бумажных сэндвич ELISA с диапазоном количественной оценки, которые охватывали семь порядков (10²-10⁹ ОРП/мл); Однако этот метод требует несколько шагов антитела покрытия и take up к целый день для пробирного⁸. Наша группа также разработала метод ИФА для количественного определения M13 Фаговые частицы, но был менее чувствительных дальность обнаружения 10⁶ – 10¹¹ ОРП/мл⁵. Переключаемый лантаноиды флуоресценции зондов были разработаны для перечисления M13 и количественной оценке данные могут быть получены в течение 20 мин; Однако, этот assay имеет узкий динамический диапазон из 10⁹ 10¹² ОРП/мл⁹. Одна группа использовала атомно-силовой микроскопии для перечисления M13 Фаговые частицы в растворе, но это требует передовых электронной микроскопии и работал только в узком диапазоне концентраций¹⁰. Другое исследование используется монодисперсных эмульсии для улавливания флуоресцентные M13 и T4 репортер бактериофаги и рассчитывать бактериофаги, количество флуоресцентные капель; Однако, этот подход также выставлены узкие количественной оценки варьируются от 10² -10⁶ ОРП/мл¹¹. При этом капельки цифровой PCR были использованы для количественной оценки M13 бактериофаги этот подход не может различать количество инфекционных и неинфекционных Фаговые частицы¹².

Наша группа недавно разработала методы ПЦР для перечисления T7 и M13 бактериофаги, определены от biopanning против blood – brain барьер ячеечная модель с использованием двух различных флуоресцентные репортер красителей⁵. По сравнению с вышеупомянутой количественной оценки методов, мы разработали методы ПЦР были высокой пропускной способности и времени эффективным количественно оценить многочисленные образцы и возможность различать инфекционных и неинфекционных бактериофаги с DNase I предварительной обработки Фаговые образцов. Важно отметить, что этот подход может можно воспроизвести и точно количественно M13 и Т7 бактериофаги от biopanning образцов. Для начинающих исследователей в области Фаговые ПЦР, здесь мы опишем подробный ПЦР метод для перечисления T7 Фаговые частицы из хвоща ограничены библиотеки (CX7C) приготовлена в vitro барьер слизь кистозный фиброз (CF). От этой работы метод ПЦР может быть продлен для количественного определения Фаговые частицы от других видов biopanning и из других источников, включая воду, почву и жидкости организма.