PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning
Summary
לשחזור מדויק, זמן יעיל כמותיים PCR (qPCR) שיטה לספור T7 bacteriophage מתואר כאן. הפרוטוקול מתאר בבירור phage הכנה דנ א גנומי, PCR התגובה הכנה, תנאי הרכיבה qPCR, ניתוח נתונים qPCR.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את השימוש PCR כמותי (qPCR) למנות T7 phages מ phage מבחר ניסויים (קרי, “biopanning”). qPCR היא גישה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית לכמת את הדנ א, הנה, זה מותאם לכמת phage הגנום כמדד עבור phage חלקיקים. ב פרוטוקול זה, שיטת הכנה phage נתיישב דנ א מתוארת באמצעות חימום בטמפרטורה גבוהה ללא טיהור DNA נוספים. השיטה צריכה רק כמויות קטנות של phages שילדת כרכים קטנים של התגובה qPCR. qPCR תפוקה גבוהה ומהיר, מסוגל לעבד ולקבל נתונים גישות אחרות ספירה phage צלחת 96-ובכן של תגובות ב- 2-4 ה Compared, qPCR יעיל יותר זמן. כאן, qPCR משמש לציון T7 phages מזוהה של biopanning נגד במבחנה , כמו סיסטיק פיברוזיס ריר מודל. בשיטת qPCR ניתן להרחיב לכמת T7 phages של ניסויים אחרים, כולל סוגים אחרים של biopanning (למשל., מרותק למיטה חלבון מחייב, אין ויוו ההקרנה phage) ומקורות אחרים (למשל, מערכות מים או נוזלי גוף). לסיכום, פרוטוקול זה יכול להיות שונה לכמת וירוסים אנקפסולציה ל- DNA.
Introduction
טכנולוגיית התצוגה bacteriophage (phage), שפותחה על ידי ג’ורג סמית בשנת 1985, היא גישה חזקה, תפוקה גבוהה לזיהוי ליגנדים פפטיד או חלבון נגד מטרות או קולטני קרום התא, מחלת אנטיגנים, organelles הסלולר או ספציפי איברים ורקמות1,שני העשורים האחרונים2. כאן, ספריות אקראי של polypeptides או שרשרת אחת נוגדנים יוצגו על החלבונים המעיל של phages (בדרך כלל M13 או T7), ניתן לזהות ליגנדים מסוים ואתה מוריד נגד חלבונים קיבוע במבחנה או vivo בתוך מערכות ביולוגיות באמצעות תהליך הבחירה איטרטיבי. לאחר מכן, ליגנדים יכול להיות יחד עם סוכני דימות או טיפולית באבחון וטיפול של מחלות3,4. זה קריטי לספור במדויק phages במהלך מספר השלבים של biopanning: (1) לכמת phages זה לאגד המצע, (2) לכמת phages כדי לקבוע אם קיים העשרה עם כל סיבוב של בחירה (העשרה phage מציין biopanned phage אהדה עבור היעד). תקן הזהב הנוכחי על כימות, שכבה כפולה פלאק assay, מציג אתגרים מרובים; זה מייגע, מסורבלת, שעשוי להיות לא מדויק עבור מספר גדול של דוגמאות. לכן, הקבוצה שלנו פיתחה שיטה תגובת שרשרת (qPCR) פולימראז כמותיים רגיש, מדויק הדירים היעילה לספור חלקיקים phage M13 ו- T7 biopanning5.
qPCR היא שיטה אפשרית ומושכת לכמת במדויק T7 ו- M13 phages. מאז כל חלקיק phage בודדים יכולים להכיל רק עותק אחד של DNA גנומי (dsDNA או ssDNA), גנום phage אחד שווה ל מחלקיק אחד phage; על ידי לכימות מספר phage הגנום, זה ריאלי כדי לכמת את מספר phages. במהלך qPCR, כתב פלורסנט צבעי לאגד דנ א גנומי phage הלא ספציפית או במפורש דרך רצף ספציפי תחל במהלך ה-PCR-הגברה, זריחה את האות עולה עם כל סיבוב של הגברה. כאשר האות פלורסצנטיות מגיע לפתח עגול/מעגל ההגברה יצויין בתור מחזור הסף (Ct). ריכוז ידוע הפניה phage DNA מותוות נגד הערכים Ct שלהם להקים עיקול רגיל. באמצעות עקומת סטנדרטי עם הערכים Ct של דגימות די אן איי, ריכוזי phages יכול להיות עם אינטרפולציה.
בעוד אסטרטגיות רבות שפותחו בעבר, נעשה שימוש נרחב לכמת phages מן biopanning, לכל אחד מהם יש אתגרים ספציפיים. השיטה המקובלת ביותר היא שכבה כפולה פלאק וזמינותו. . הנה, המארח חיידקים נגועים phages מוכן במלון דילולים טורי, הם מצופים על מצע אגר מוצק, הערוכים בשכבות עם אגר; phages ממוספרים עם המספר של הפלאק נוצר (קרי, יחידות ויוצרים רובד או pfu) צלחת אגר. פלאק assay הוא רגיש אבל מייגע, זמן רב ולא מדויקות, במיוחד עבור דוגמאות רבות, עם ריכוזים גבוהים5. בנוסף, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) הותאמו למנות M13 ו T7 phage חלקיקים6,7,8. . הנה, phages-דילולים שונים מאוגדים, שנתפסו על מצע מוצק (קרי, microplate), שנבדק עם נוגדנים ספציפיים phage ולאחר שאותרו על-ידי שימוש כתבים (לדוגמה, אנזים רגיש סובסטרטים הדפסות כסף, fluorophores) לקבוע את מספר החלקיקים phage הנוכחי. הקריאות (למשל, זריחה, ספיגת) של דגימות ניתן לכמת ריכוזים לא ידוע נגד phage סטנדרטים בריכוזים ידועים. ELISAs מבוססי phage שונים פותחו אבל יש להם מגבלות אפשריות. קבוצה אחת פיתחה המבוסס על נייר כריך אליסה עם מגוון כימות שהשתרעו שבע סדרי גודל (102-109 pfu/mL); עם זאת, שיטה זו נדרש מספר השלבים של נוגדן ציפוי ולקח ליום שלם עבור assay8. הקבוצה שלנו גם פיתח שיטה אליסה לכמת M13 phage חלקיקים אך היה פחות רגיש זיהוי טווח של 106 כדי 11 10 pfu/mL5. לנתניד להחלפה פלורסצנטיות הגששים פותחו כדי למנות M13, כימות הנתונים יכולה להיות מושגת תוך 20 דקות; עם זאת, זו assay יש טווח דינמי צר של 109 ל-12 10 pfu/mL9. קבוצה אחת בשימוש מיקרוסקופ כוח אטומי למנות M13 phage חלקיקים בתמיסה, אך זה דורש מיקרוסקופ אלקטרונים מתקדמים, עבד רק בטווח צר של ריכוזים10. מחקר נוסף המשמש monodisperse אמולסיות השמנה phages כתב פלורסנט M13 ו- 4t ולספור phages לפי מספר טיפות פלורסנט; עם זאת, גישה זו גם הציג מגוון כימות צר מ-102 ל-6 10 pfu/mL11. בזמן droplet ש-PCR דיגיטלית נעשה שימוש כדי לכמת M13 phages, גישה זו אין אפשרות להבחין בין מספר חלקיקים phage זיהומיות וזיהומיות הלא12.
הקבוצה שלנו לאחרונה פיתחה שיטות qPCR למנות phages T7 ו- M13 מזוהה של biopanning נגד מודל תא מחסום הדם – מוח באמצעות הכתב שונה פלורסנט שני צבעי5. בהשוואה לשיטות כימות הנ ל, השיטות qPCR פיתחנו היו תפוקה גבוהה, היעילה לכמת מדגמים רבים מסוגלים להבדיל בין phages זיהומית, שאינן זיהומיות עם DNase שאני קדם בטיפול ו phage דגימות. חשוב לציין, גישה זו יכולים reproducibly ובדייקנות לכמת bacteriophages M13 ו- T7 מדגימות biopanning. כדי להדריך המתחיל חוקרים בתחום phage qPCR, כאן אנו מתארים שיטה qPCR מפורט לספור חלקיקים phage T7 מספריית מוגבל-ציסטאין (CX7C) הזזה נגד מכשול ריר סיסטיק פיברוזיס (CF) במבחנה . מהעבודה הזאת, ניתן להרחיב qPCR שיטת לכמת חלקיקים phage מסוגים אחרים של biopanning, ממקורות אחרים, כולל מים, קרקע של נוזלי הגוף.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו שיטות qPCR לכמת phage דנ א גנומי5, כאן אנו המתואר ומותאמים שיטה qPCR למנות T7 phages שנבחרו נגד מחסום CF דמוי ריר. מידע מינימלי עבור הפרסום של כמותיים בזמן אמת PCR ניסויים (MIQE) הנחיות הוסבו לפתח, לאמת את שיטת qPCR עבור ספירה של T7 phages15. פרוטוקול פיתחנו לכמת phages של ניסויים biopannin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי חברת פארמה קרן מחקר Starter גרנט ולהעניק הלאומי ללב, ריאות, מכון דם של מכוני הבריאות הלאומיים תחת מספר פרס R01HL138251.
Materials
| Materials and reagents | |||
| Primers for T7 genomic DNA | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT |
|
| T7Select packaging control DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR master mix–Power up SYBR Green master mix | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp optical adhesive film kit | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 Cloning Kit | EMD Millipore | 70015 | User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I solution | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24-well transwell plate | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21040CV | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater | ThermoFisher Scientific | Model:2001 | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| QuantStudio Real-time PCR software | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| Real-time qPCR primer design | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
References
- Smith, G. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chemical Reviews. 97 (96), 391-410 (1997).
- Sergeeva, A., Kolonin, M. G., Molldrem, J. J., Pasqualini, R., Arap, W. Display technologies: Application for the discovery of drug and gene delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1622-1654 (2006).
- Dias-Neto, E., et al. Next-generation phage display: Integrating and comparing available molecular tools to enable costeffective high-throughput analysis. PLoS ONE. 4 (12), 1-11 (2009).
- Peng, X., Nguyen, A., Ghosh, D. Quantification of M13 and T7 bacteriophages by TaqMan and SYBR green qPCR. Journal of Virological Methods. 252 (June 2017), 100-107 (2017).
- Khan, M. S., Pande, T., Mvan de Ven, T. G. Qualitative and quantitative detection of T7 bacteriophages using paper based sandwich ELISA. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 132, 264-270 (2015).
- Brasino, M., Lee, J. H., Cha, J. N. Creating highly amplified enzyme-linked immunosorbent assay signals from genetically engineered bacteriophage. Analytical Biochemistry. 470, 7-13 (2014).
- Yu, X., Burgoon, M., Shearer, A., Gilden, D. Characterization of phage peptide interaction with antibody using phage mediated immuno-PCR. J immunol Methods. 326 (1-2), 33-40 (2007).
- Lehmusvuori, A., Manninen, J., Huovinen, T., Soukka, T., Lamminmäki, U. Homogenous M13 bacteriophage quantification assay using switchable lanthanide fluorescence probes. BioTechniques. 53 (5), 301-303 (2012).
- Schlaman, H. R. M., et al. Analysis of interactions of signaling proteins with phage-displayed ligands by fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Biomolecular Screening. 13 (8), 766-776 (2008).
- Tjhung, K. F., Burnham, S., Anany, H., Griffiths, M. W., Derda, R. Rapid enumeration of phage in monodisperse emulsions. Analytical Chemistry. 86 (12), 5642-5648 (2014).
- Reitinger, S., Petriv, O. I., Mehr, K., Hansen, C. L., Withers, S. G. Purification and quantitation of bacteriophage M13 using desalting spin columns and digital PCR. Journal of Virological Methods. 185 (1), 171-174 (2012).
- . T7Select® Biopanning Kit Available from: https://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-Biopanning-Kit (2018)
- Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. Linear Regression Analysis. Deutsches Ärzteblatt international. 107 (44), 776-782 (2010).
- Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggert, J. The MIQE Guidelines: Minimun information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemitry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. -. J., Wilson, J. M. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR. Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Fittipaldi, M., et al. Discrimination of infectious bacteriophage T4 virus by propidium monoazide real-time PCR. Journal of Virological Methods. 168 (1-2), 228-232 (2010).
- Lodder, W. J., et al. Reduction of bacteriophage MS2 by filtration and irradiation determined by culture and quantitative real-time RT-PCR. Journal of Water and Health. 11 (2), 256-266 (2013).
- Brown-Jaque, M., et al. Antibiotic resistance genes in phage particles isolated from human feces and induced from clinical bacterial isolates. International Journal of Antimicrobial Agents. , (2017).
- Naveca, F. G., et al. Multiplexed reverse transcription real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of Mayaro, Oropouche, and oropouche-like viruses. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (7), 510-513 (2017).
- Jia, J., et al. Simultaneous detection and differentiation of human parvovirus B19 and human parvovirus 4 by an internally controlled multiplex quantitative real-time PCR. Molecular and Cellular Probes. 36, 50-57 (2017).
- Bliem, R., et al. A novel triplex quantitative pcr strategy for quantification of toxigenic and nontoxigenic Vibrio cholerae in aquatic environments. Applied and Environmental Microbiology. 81 (9), 3077-3085 (2015).
- Wan, Z., Goddard, N. L. Competition Between Conjugation and M13 Phage Infection in Escherichia coli in the Absence of Selection Pressure: A Kinetic Study. G3 Genes|Genomes|Genetics. 2 (10), 1137-1144 (2012).
