PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning

Tecnologia di visualizzazione del batteriofago (fago), sviluppata da George Smith nel 1985, è un approccio potente, ad alta produttività per identificare ligandi del peptide o della proteina contro bersagli o recettori dalla membrana cellulare, gli antigeni malattia, organelli cellulari o specifici organi e tessuti in passato due decenni^1,2. Qui, librerie casuale di polipeptidi o singola catena anticorpi vengono visualizzate sulle proteine cappotto di fagi (in genere M13 o T7) e ligandi specifici possono essere identificati da panning contro proteine immobilizzate in vitro o in vivo sistemi biologici attraverso un processo di selezione iterativi. Quindi, ligandi possono essere accoppiati con agenti terapeutici o di imaging per la diagnosi ed il trattamento di malattie^3,4. È fondamentale per enumerare accuratamente fagi durante più passaggi di biopanning: (1) per quantificare i fagi che si legano al substrato e (2) quantificare fagi per determinare se c’è l’arricchimento con ogni turno di selezione (arricchimento dei fagi indica biopanned affinità dei fagi per la destinazione). Il gold standard attuale per la quantificazione, saggio della placca doppio strato, presenta sfide multiple; è noioso, ingombrante e potenzialmente non accurati per un gran numero di campioni. Di conseguenza, il nostro gruppo ha sviluppato un metodo di reazione a catena (qPCR) della polimerasi quantitativa sensibile, riproducibile, preciso e rapido per enumerare le particelle dei fagi M13 e T7 da biopanning⁵.

qPCR è un metodo attraente e fattibile quantificare con precisione T7 e M13 fagi. Poiché ogni particella individuale dei fagi può contenere solo una copia del DNA genomico (dsDNA o ssDNA), uno dei fagi genoma è equivalente a una particella fago; quantificando il numero di genomi dei fagi, è fattibile quantificare il numero di fagi. Durante qPCR, reporter fluorescente tinture legano il DNA genomico dei fagi non specifico o in particolare attraverso gli iniettori sequenza-specifici durante l’amplificazione di PCR e la fluorescenza segnale aumenta con ogni ciclo di amplificazione. Quando il segnale di fluorescenza raggiunge la soglia, che turno/ciclo di amplificazione è noto come il ciclo di soglia (Ct). Le concentrazioni note di fago riferimento DNA vengono confrontate con i valori di Ct per stabilire una curva standard. Utilizzando la curva standard con i valori di Ct di campioni di DNA, le concentrazioni di fagi possono essere interpolate.

Mentre numerose strategie sviluppate in precedenza e ampiamente utilizzate per quantificare i fagi da biopanning, ognuno di loro ha specifiche sfide. Il metodo più popolare e convenzionale è saggio della placca doppio strato. Qui, alcuni batteri sono infettati con fagi preparati alle diluizioni seriali, sono placcati su un substrato solido agar e sono overlaid con agar; fagi vengono enumerate con il numero delle placche formate (cioè, unità di formazione di placca o pfu) sulla piastra di agar. Saggio della placca è sensibile ma noioso, che richiede tempo e imprecise, soprattutto per i numerosi campioni e con alte concentrazioni di⁵. Inoltre, analisi enzima-collegate dell’immunosorbente (ELISA) sono state adattate per enumerare M13 e T7 fago particelle^6,7,8. Qui, fagi a varie diluizioni sono vincolati e catturato su un substrato solido (cioè, una micropiastra), sondato con gli anticorpi dei fagi-specific e rilevato utilizzando reporter (ad es., substrati cromogeni sensibili enzima, fluorofori) per determinare il numero di particelle fagiche presenti. Letture (ad es., fluorescenza, assorbanza) dei campioni possono essere utilizzate per quantificare le concentrazioni sconosciute contro gli standard dei fagi a concentrazioni note. Sono state sviluppate diverse basati su fagi ELISAs ma hanno limitazioni potenziali. Un gruppo ha sviluppato un panino cartacei ELISA con una gamma di quantificazione che durò sette ordini di grandezza (²-10 10⁹ pfu/mL); Tuttavia, questo metodo necessari più passaggi di rivestimento dell’anticorpo ed ha preso per un’intera giornata per il dosaggio di⁸. Anche il nostro gruppo ha sviluppato un metodo per quantificare le particelle dei fagi M13 ma aveva una gamma meno sensibile di rilevazione di 10⁶ a 10¹¹ pfu/mL⁵. Commutabile lantanidi fluorescenza sonde sono state sviluppate per enumerare M13 e quantificazione dati potrebbero essere ottenuti entro 20 min; Tuttavia, questo test ha una gamma dinamica stretta di 10⁹ al 10¹² pfu/mL⁹. Un gruppo ha usato Microscopia a forza atomica per enumerare le particelle dei fagi M13 in soluzione, ma questo richiede la microscopia elettronica avanzata e funzionava solo all’interno di una ristretta gamma di concentrazioni¹⁰. Un altro studio ha utilizzato monodispersi emulsioni per intrappolare fagi reporter fluorescente M13 e T4 e contare i fagi per il numero di goccioline fluorescente; Tuttavia, questo approccio inoltre hanno esibito una gamma stretta quantificazione da 10² 10⁶ pfu/mL¹¹. Mentre gocciolina che digitale PCR è stato utilizzato per quantificare i fagi M13, questo approccio è in grado di distinguere tra il numero di malattie infettive e non infettive dei fagi particelle¹².

Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato metodi qPCR per enumerare T7 e M13 fagi identificati da biopanning contro un modello di cellulare della barriera emato – encefalica utilizzando due diversi reporter fluorescente tinture⁵. Rispetto ai metodi di quantificazione di cui sopra, i metodi di qPCR abbiamo sviluppato erano ad alta velocità e tempo efficiente per quantificare numerosi campioni e in grado di distinguere tra fagi infettive e non infettive con dnasi I pre-trattamento della campioni dei fagi. Cosa importante, questo approccio può riproducibile e accuratamente quantificare batteriofagi M13 e T7 da campioni di biopanning. Per guidare i ricercatori alle prime armi nella zona di fago qPCR, qui descriviamo un metodo qPCR dettagliate per enumerare le particelle dei fagi T7 da una libreria di cisteina-vincolato (CX7C) stroncate contro una barriera muco in vitro della fibrosi cistica (CF). Da questo lavoro, qPCR metodo può essere esteso per quantificare le particelle dei fagi da altri tipi di biopanning e da altre fonti, tra cui acqua, il suolo e fluidi corporei.