PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

عاثية (بالعاثية) عرض التكنولوجيا، وضعت من قبل جورج سميث في عام 1985، نهج قوية، الفائق لتحديد يغاندس الببتيد أو البروتين ضد أهداف أو مستقبلات من غشاء الخلية، ومولدات الأمراض، العضيات الخلوية أو محددة والأنسجة في العقدين الماضيين^1،الماضي². هنا، يتم عرض المكتبات عشوائي البروتينية أو الأجسام المضادة لسلسلة واحدة على البروتينات معطف من فاجيس (عادة M13 أو T7)، ويغاندس معينة يمكن تحديدها من الغسل ضد البروتينات المعطل تداولها في المختبر أو في الجسم الحي النظم البيولوجية من خلال عملية اختيار تكرارية. ثم، يمكن أن يقترن يغاندس مع وكلاء التصوير أو العلاجية لتشخيص وعلاج الأمراض^3،4. من الأهمية بمكان لدقة تعداد فاجيس خلال خطوات متعددة من بيوبانينج: (1) لقياس فاجيس التي تربط إلى الركيزة و (2) لقياس فاجيس لتحديد ما إذا كان هناك إثراء مع كل جولة من التحديد (الإثراء بالعاثية يشير إلى بيوبانيد تقارب بالعاثية للهدف). معيار الذهب الحالية للقياس الكمي، اللوحة طبقة مزدوجة بالانزيم، تحديات متعددة؛ أنها شاقة ومرهقة، ويحتمل أن تكون غير دقيقة لعدد كبير من العينات. ولذلك، وضعت مجموعتنا أسلوب سلسلة من ردود فعل (qPCR) بوليميريز كمية الحساسة واستنساخه، ودقيقة وفعالة من حيث الوقت لتعداد الجسيمات بالعاثية M13 و T7 من بيوبانينج⁵.

qPCR أسلوباً جذاباً ومجديا لقياس دقة فاجيس T7 و M13. حيث يمكن أن تحتوي كل الجسيمات بالعاثية الفردية فقط نسخة واحدة من الحمض النووي (دسدنا أو ssDNA)، واحد بالعاثية الجينوم يساوي واحد بالعاثية الجسيمات؛ بالتحديد الكمي لعدد مورثات بالعاثية، أنه من الممكن تحديد عدد فاجيس. أثناء قبكر، مراسل الفلورية الأصباغ ربط بالعاثية المجينية الحمض النووي غير تحديداً أو على وجه التحديد عن طريق الإشعال الخاصة بالتسلسل خلال التضخيم PCR، والأسفار إشارة يزيد مع كل جولة من التضخيم. ويلاحظ عند وصول إشارة الأسفار إلى العتبة، أن الجولة/دورة التضخيم كدورة عتبة (Ct). يتم رسم تركيزات معروفة من مرجع بالعاثية الحمض النووي ضد قيمها Ct إنشاء منحنى قياسي. استخدام المنحنى القياسي مع القيم المقطعية لعينات من الحمض النووي، يمكن أن يكون محرف تركيزات فاجيس.

في حين تم سبق أن وضعت استراتيجيات عديدة وتستخدم على نطاق واسع لقياس فاجيس من بيوبانينج، كل واحد منهم لديه تحديات معينة. هو الأسلوب الأكثر شعبية وتقليدية المقايسة البلاك طبقة مزدوجة. هنا، المضيف البكتيريا مصابون فاجيس أعد في تخفيف المسلسل وهي مطلية على ركيزة صلبة أجار، ويتم مضافين مع أجار؛ يتم تعداد فاجيس مع عدد اللوحات شكلت (أي، الوحدات تشكيل اللوحة أو بفو) على اللوحة أجار. فحص اللوحة الحساسة ولكن شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً وغير دقيقة، خاصة بالنسبة لعينات عديدة ومع تركيزات عالية⁵. بالإضافة إلى ذلك، جرى تكييف لتعداد M13 و T7 بالعاثية الجسيمات^6،،من⁷⁸فحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). هنا، هي ملزمة فاجيس في تخفيف مختلفة واستولت على الركازة صلبة (أي، ميكروسكوبية) وسبر مع الأجسام المضادة بالعاثية محددة، والكشف عنها بواسطة استخدام الصحفيين (مثلاً إنزيم الحساسة ركائز اللونية، fluorophores) إلى تحديد عدد الجسيمات بالعاثية الحالية. قراءات (مثلاً، الأسفار، وامتصاص) من عينات يمكن استخدامها لقياس تركيزات غير معروفة ضد المعايير بالعاثية بتركيزات معروفة. مختلفة وقد وضعت على أساس بالعاثية اليساس ولكن لديهم القيود المحتملة. ووضع الفريق واحد الورقية ساندويتش أليسا مع مجموعة القياس الكمي التي امتدت سبعة أوامر من حجم (²-10 10،⁹ بفو/mL)؛ ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب خطوات متعددة من طلاء جسم وأخذت إلى يوم كامل ل الفحص⁸. مجموعتنا أيضا تطوير أسلوب أليسا لقياس الجسيمات بالعاثية M13 ولكن كان أقل حساسية الكشف عن مجموعة من 10⁶ إلى بفو/مل¹¹ 10⁵. تم وضع المسابر fluorescence لانثانيدات التحويل لتعداد M13 ويمكن الحصول على بيانات القياس الكمي في غضون 20 دقيقة؛ ومع ذلك، قد هذا التحليل مجموعة ديناميكية ضيقة من 10⁹ إلى 10¹² مل بفو/⁹. مجموعة واحدة استخدام مجهر القوة الذرية لتعداد M13 بالعاثية الجسيمات في الحل، ولكن هذا يتطلب الميكروسكوب الإلكتروني المتقدمة وعملت فقط ضمن نطاق ضيق من تركيزات¹⁰. دراسة أخرى تستخدم المستحلبات مونوديسبيرسي إلى فخ فاجيس مراسل M13 و T4 الفلورسنت وحساب فاجيس بعدد قطرات الفلورية؛ ومع ذلك، أظهر هذا النهج أيضا طائفة ضيقة الكمي من 10² إلى⁶ 10 مل بفو/¹¹. بينما الحبرية PCR الرقمية قد استخدمت لقياس فاجيس M13، أن هذا النهج غير قادر على التفريق بين العدد من الأمراض المعدية وغير المعدية بالعاثية الجسيمات¹².

ووضعت مجموعتنا مؤخرا أساليب qPCR لتعداد فاجيس T7 و M13 وحدد من بيوبانينج ضد نموذج خلية حاجز الدم في الدماغ باستخدام الأصباغ مراسل الفلورسنت مختلفة اثنين⁵. مقارنة بأساليب القياس الكمي المشار إليها أعلاه، قمنا بتطوير أساليب qPCR كانت الفائق، وكفاءة من حيث الوقت لقياس عينات عديدة وقادرة على التفريق بين الأمراض المعدية وغير المعدية فاجيس مع الدناز أنا ما قبل المعالجة بالعاثية العينات. الأهم من ذلك، هذا النهج يمكن أن تكاثر ودقة قياس bacteriophages M13 و T7 من عينات بيوبانينج. لتوجيه الباحثين المبتدئين في مجال qPCR بالعاثية، هنا يصف لنا طريقة qPCR مفصلة لتعداد T7 بالعاثية الجسيمات من مكتبة مقيدة سيستين (CX7C) انتقادات ضد حاجز مخاط تليف الكيسي (CF) في المختبر . من هذا العمل، ويمكن تمديد الأسلوب قبكر تحديد حجم الجسيمات بالعاثية من أنواع أخرى من بيوبانينج ومن مصادر أخرى، بما في ذلك المياه والتربة، وسوائل الجسم.