Изоляция и характеристика опухолевых клеток от саркомы пациента полученных Xenografts

Все протоколы для экспериментов с мышью, обсуждаемые здесь, были в соответствии с институциональными руководящими принципами и одобрены Медицинским центром Маунт-Синай институциональным комитетом по исследованию человека и Комитетом по уходу за животными и использованию. 1. Обработка образца саркомы ткани, и ОБРАЗОВАНИЕ PDX В соответствии с утвержденным Институциональным наблюдательным протоколом сотрудники патологической службы готовят образцы саркомы из образцов хирургии и сразу же кладут каждый образец на лед в 100-мм чашке Петри. Поместите образец в 15 мл полистирола конической трубки с 6 мл холодной Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 культуры среды дополнены 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин / стрептомицин. Немедленно обработайте образец ткани. (Необязательно) Для остеосаркомы только, следуйте следующим шагам, которые могут быть пропущены для саркомы мягких тканей. Разрежьте ткань на 20 мм3 кусочки с помощью скальпеля. Перенесите кусочки ткани в трубку 15 мл, содержащую 3 мл коллагеназного раствора (RPMI 1640 с коллагеназой 1 мг/мл). Положите трубку в водяную баню при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Тщательно вихрь трубки, а затем, добавить 3 мл RPMI 1640 дополнены 10% FBS, чтобы нейтрализовать активность коллагеназы. Центрифуга в течение 5 мин при температуре в комнате 350 х г. Удалите супернатант. Работая в стерильном шкафу биобезопасности, поместите образец ткани в 100 мм чашку Петри. Добавьте в ткани 500 л стерильного 1x фосфатно-буферного солей (PBS). С помощью стерильного скальпеля механически тритуруирует ткань на мелкие кусочки, пока ни одна видимая часть ткани не будет больше 0,1 мм. Перенесите суспензию 500 л клеток на 35-мм ячеек и соберите фильтрованную подвеску с помощью трубки полистирола мощностью 50 мл. Положите эту трубку из 50 мл полистирола с клеточной подвеской на лед. Добавьте в ткани еще 500 л ПБС. Triturate во второй раз, передача подвески через ячейку ситечко, и собрать его в тот же 50 мл трубки. Повторите эти шаги (шаги 1,5-1,6) до тех пор, пока секция ткани полностью не разобщена, обычно 6x – 8x. Пеллетите клеточную подвеску центрифугированием при температуре 350 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта, отостановите гранулы с помощью 5 мл буфера гемолиза (0,15 М НМ4Cl, 10 мМ KHCO3,и 0,1 мМ EDTA), и инкубировать раствор в течение 5 минут при комнатной температуре для удаления красных кровяных телец. Центрифуга в течение 5 мин при температуре 350 х г при комнатной температуре и удалите буфер гемолиза. Вымойте гранулы с 5 мл PBS. Центрифуге снова в течение 5 мин при 350 х г и удалить супернатант. Отрежь гранулы с 1 мл PBS и рассчитывать жизнеспособный номер ячейки с помощью гемоситометра или любой другой альтернативный метод. Разбавить клетки до конечной концентрации 1 х 107 клеток в 200 Л Л PbS. Оставьте подвеску клетки на льду. Оставьте подвальную мембранную матрицу на льду, чтобы она растаяла. Добавьте 200 зл и подвальной мембранной матрицы к 200-й клеточной подвеске. Аккуратно перемешайте и держите на льду. Подкожно вводят клеточную подвеску: мембранную матрицу (1:1) в две мышки NOD scid gamma (NSG) на их фланги. Используйте 200 л для каждой инъекции. Мониторинг формирования PDX, проверяя место инъекции мышей 2x в неделю. Удалить опухоль ксенотрансвтат, когда она достигает 1 см в диаметре. 2. Изоляция опухолевых клеток FACS от PDX Хирургически удалить PDX от мышей, как описано ранее12. Разрежьте опухоль пополам. Исправить половину ксенотранспланта с 4% параформальдегида в одночасье. Это для гистологического анализа. Обработайте другую половину ткани, как описано выше (шаги 1.3-1.8), чтобы получить суспензию опухолевых клеток. Resuspend гранулы с PBS и рассчитывать жизнеспособный номер ячейки. Разбавить клеточной суспензии в PBS дополнили 5% FBS до концентрации 2 х 106 клеток/мл. Оставьте суспензию клетки на льду на 30 мин. Разделите суспензию клетки на две трубки. Отметьте трубки изотопным контролем и антителами, соответственно. Обратите внимание на количество клеток в каждой трубке. Подготовка 2x HLA-1-PE антитела путем разбавления антитела с PBS дополнены 5% FBS (1:250). Разбавить отрицательный изотип контроля антитела с тем же условием. Смешайте суспензию клеток из трубки «антитела» с разбавленным антителом (1:1), чтобы сделать окончательное разбавление антител 1:500. Смешайте суспензию клеток из трубки «изотопного управления» с изотопным управлением (1:1). Положите клеточные суспензии на льду на 90 мин. Центрифуга в течение 5 мин при 350 х г при 4 градусах по Цельсию и удалите супернатант. Добавьте 10 мл PBS для мытья гранул 2x. Добавьте 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в PBS до конечной концентрации 10 мкг/мл. Добавьте этот раствор DAPI в клеточные гранулы, чтобы сделать клеточную подвеску 107 ячеек/мл (с помощью номеров клеток от шага 2.4). Фильтр яточной подвески через 35 мкм крышки ситечко в 12 мм х 75 мм полистирола труб. Используйте цитометр потока для сортировки HLA-1-негативной субпопуляции TIC6. Ворота жизнеспособных клеток (DAPI-отрицательный) и собирать как HLA-1-отрицательных и -положительных субпопуляций в двух 15 мл коллекционных труб, каждая из которых содержит 4 мл RPMI 1640 культуры среды. 3. Характеристика опухолевых клеток Формирование саркосферы Сделайте среду роста саркосферы, используя среду культуры клеток альфа-MEM. Добавить добавки, чтобы сделать окончательную концентрацию B-27 добавки (1x), N2 добавки (1x), основной фактор роста фибробластов (bFGF) (20 нг/мл), и эпидермальный фактор роста (EGF) (20 нг/мл) и пенициллин / стрептомицин (100 МЕ/мл). Фильтр среды с 0,2 мкм фильтр культуры клеток перед использованием. Пеллет сортированное HLA-1-отрицательное и -положительное субпопуляция от шага 2.9 и подсчитывает номера клеток каждой субпопуляции. Разбавить 1,5 х 106 клеток в 15 мл среды роста саркосферы, чтобы сделать разбавление клеток 1 х 105 клеток/мл. Последовательно разбавить клетки со свежей саркосферной среды роста, чтобысделать 15 мл каждой клетки разбавления 10 4, 103,и 102 клетки / мл. Затем приготовьте четыре 96-ну хорошо ультра-низкие пластины культуры клеток вложения, каждый для разбавления клеток. Передача 100 л клеточной подвески от 105 клеток/мл разбавления к каждой скважине из первого 96-хорошо ультра-низкой пластины культуры клеток вложения. Эта пластина имеет 104 клеток в каждом колодце. Используйте другие три 96-хорошо ультра-низкий вложения клеточнойкультуры пластин для других трех клеток разбавления: 10 4, 103,и 102 клетки / мл. Передача 100 л клеточной подвески к каждой скважине 96-хорошо ультра-низких пластин культуры вложений. Эти три культурные пластины имеют 1000 клеток/ ну, 100 клеток/ну и 10 клеток/ну, соответственно. Положите пластины в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 культуры клеток инкубатора. Добавляйте новые bFGF и EGF непосредственно в среду клеточной культуры (окончательная концентрация 20 нг/мл) каждые три дня без изменения среды, чтобы избежать потери клеток в культуре подвески. Используя легкий микроскоп, следите за формированием саркосферы каждый день в течение трех недель, как показано на рисунке 2A. Через три недели подсчитайте количество саркосферно-положительных скважин и саркосферно-отрицательных скважин каждой клеточной разбавления как для HLA-1-отрицательных, так и для HLA-1-положительных клеток. Рассчитайте частоту шарообразующих клеток на основе распределения вероятности Пуассона13. Сравните HLA-1-отрицательные TICs с HLA-1-положительных навалочных ячеек. Серийное разбавление опухолевого образования Подсчитайте HLA-1-отрицательные и -положительные субпопуляции от шага 2.9. Сделать серийное разбавление клеток сPBS до концентраций 10 6, 105,104,и 103 клеток /мл. Используйте 1 мл каждого разбавления для формирования опухоли у 10 мышей. Добавьте 1 мл мембранной матрицы в 1 мл клеточной подвески каждого разбавления (1:1). Держите 2 мл каждой смеси на льду. Подкожно вводят 200 зЛ клеточной: мембранной матричной смеси в фланги мышей NGS, используя HLA-1-отрицательные клетки для одного фланга и HLA-1-положительные клетки для другого фланга той же мыши. Для каждого разбавления используйте 10 мышей. Используйте шприцы 25G с иглой для инъекций. Мониторинг образования опухоли у мышей в течение четырех-восьми недель, в зависимости от скорости роста опухоли. Рассчитайте частоту клеток, испотянувщих опухоль, по проценту формирования опухоли при различных числах входных клеток. Сравните HLA-1-отрицательные TICs с HLA-1-положительных навалочных ячеек. Индуцированная дифференциация вдоль мезенхимальных путей Используйте саркосферы, сформированные во время предыдущих шагов (шаг 3.1.9). Перенесите саркосферы на новую 6-колодую пластину. Культура саркосферы с 2,5 мл альфа-MEM дополнены 10% FBS, чтобы клетки прикрепляются к поверхности пластины культуры. После вложения в течение двух дней, переключить культуры среды от альфа-MEM дополняется 10% FBS на 1:1 смесь альфа-MEM дополняется 10% FBS и человека мезенхимальной стволовых клеток (hMSC) среды роста. Через два дня переключитесь на полную среду роста HMSC. Когда клетки достигают 90% всблючи, аспирировать среды HMSC и добавить дифференциации среды. Для остеогенной дифференциации добавьте остеогенную дифференциацию среды (среда роста HMSC дополнена 10 нм дексаметазоном, 5 ММ-глицерофосфатом, 50 мкг/мл L-аскорбиновой кислоты и 10 мм хлорид лития). Для липогенной дифференциации добавьте среду дифференциации адипоцитов (среда роста HMSC дополнена 0,5 мкм дексаметазоном, 0,5 мкм изобутилметилксантином и 50 мкм индометацином). Изменяйте среду дифференциации каждые три дня. После трех-четырех недель, остановить дифференциацию и мыть клетки с PBS. Затем, аспирировать PBS и добавить 2 мл 10% формалин в клетки для фиксации. Пусть клетки сидят в течение 45 минут при комнатной температуре. Вымойте их деионизированной водой. Клетки теперь готовы к окрашиванию Alizarin Red S (шаг 3.3.6.1) или окрашиванию маслом Red O (шаг 3.3.6.2). Чтобы обнаружить остеогенную дифференциацию, выполните окрашивание Ализарин омичи. Аспирировать воду и добавить 2 мл Ализарин Красный S рабочий раствор (2% Ализарин Красный S, рН 6.0) в клетки, и пусть они сидят в течение 5 минут для окрашивания. Вымойте клетки деионизированной водой и наблюдайте за реакцией микроскопически. Чтобы обнаружить адипогенную дифференциацию, выполните масляное красное окрашивание. Сделать масло Красный O решение. Подготовьте бульонный раствор, добавив 300 мг порошка Oil Red O в 100 мл изопропанола. В течение 2 ч перед использованием смешайте три части (30 мл) масляного раствора Сепарт с двумя частями (20 мл) деионированной воды. Разрешить смесь сидеть в течение 10 минут при комнатной температуре. Фильтр рабочего решения, используя перед использованием. Удалите воду из клеток, подготовленных в соответствии с шагом 3.3.6. Добавьте 2 мл 60% изопропанола, чтобы покрыть монослой клетки и клетки сидят в течение 2 минут. Удалить изопропанол и добавить 2 мл масла Красный O рабочего решения. Разрешить клеткам сидеть в течение 5 минут при комнатной температуре. Промыть клетки деионизированной водой и наблюдать за реакцией под световым микроскопом.