عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts
Summary
نحن نصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما البشرية المستمدة من المريض xenografts عن طريق فرز الخلايا تنشيط الفلورة، وذلك باستخدام مستضد الكريات البيض البشرية-1 (HLA-1) كعلامة سلبية، ولمزيد من التحقق من صحة و توصيف هذه الخلايا HLA-1-السلبية التي تبدأ الورم.
Abstract
وقد تم دعم وجود وأهمية الخلايا التي تبدأ الورم (TICs) من خلال زيادة الأدلة خلال العقد الماضي. وقد ثبت أن هذه TICs تكون مسؤولة عن بدء الورم، وورم خبيث، ومقاومة المخدرات. ولذلك، من المهم تطوير علاج محدد يستهدف TIC بالإضافة إلى استراتيجيات العلاج الكيميائي الحالية، والتي تركز في الغالب على الجزء الأكبر من غير TICs. ومن أجل زيادة فهم الآلية الكامنة وراء الأورام الخبيثة للمراكز، فإننا نوصف طريقة لعزل وتوصيف هذه المراكز في الساركوما البشرية. هنا، نعرض بروتوكول مفصل لتوليد xenografts المستمدة من المريض (PDXs) من ساركوما الإنسان وعزل TICs عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) باستخدام مستضد الكريات البيض البشرية الفئة الأولى (HLA-1) كعلامة سلبية. أيضا، ونحن نصف كيفية توصيف وظيفيا هذه TICs، بما في ذلك إجراء بفحص تشكيل الكرة ونموذج تشكيل الورم، وللحث على التمايز على طول مسارات mesenchymal. إن عزل وتوصيف أجهزة المعالجة الشخصية PDX توفر أدلة على اكتشاف الكواشف العلاجية المستهدفة المحتملة. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يوسع نطاقه ليشمل عزل وتوصيف الـ TICs عن الأنواع الأخرى من السرطانات البشرية.
Introduction
وقد تم دعم عدم تجانس الخلايا داخل الورم من السرطانات البشرية من خلال زيادة الأدلة خلال العقد الماضي1. على غرار الأنسجة الطبيعية، تتكون أنسجة السرطان من مجموعة فرعية صغيرة من TICs (وتسمى أيضا الخلايا الجذعية السرطانية)، والتي تظهر القدرة على تشكيل الورم. وفي الوقت نفسه، فإن الجزء الأكبر من الخلايا السرطانية تظهر الأنماط الظاهرية المتمايزة2. هذه TICs تظهر خصائص تشبه الخلايا الجذعية، بما في ذلك التعبير عن علامة الخلايا الجذعية وقدرة كل من التجديد الذاتي وتقسيم الخلايا غير المتماثلة، وبالتالي، يمكن أن تبدأ في تشكيل ورم غير متجانس ة الخلوية3. وقد كشفت الدراسات الحديثة أن TICs ليست مسؤولة فقط عن بدء الورم ولكن ترتبط أيضا مع عدوانية الورم4, الانبثاث5, ومقاومة المخدرات6. ولذلك، من المهم فهم بيولوجيا هذه البلدان، وبالتالي وضع استراتيجية علاجية محددة تستهدف هذه البلدان.
وقد استخدمت الأساليب المستندة إلى نظام المعلومات المتعلقة بالفضاء الإقليمي لتحديد TICs باستخدام علامات TICs، بما في ذلك CD133 وCD24 وCD441. يتم التعبير عن معظم هذه العلامات أيضا في الخلايا الجذعية العادية7. ومع ذلك، لا يوجد أي من هذه العلامات فقط وضع علامة على TICs. الأدوار التي تلعبها هذه الجزيئات في الأورام الخبيثة من TICs لا تزال غير واضحة. على سبيل المثال، يمكن تعطيل CD133 في كثير من الأحيان عن طريق مثيلة الحمض النووي، وبالتالي، فإن هذا التباين بين الأورام قد يجعل دقة هذه العلامات8. ALDH1 هو علامة التي تعمل أيضا للحفاظعلى الجذعية من TICs 9. يبدو أن تكون أكثر فعالية في تحديد سرطان الثدي TICs ولكن لا يزال مشكوكا فيه في أنواع الأورام الأخرى9. بعض مسارات الإشارة تلعب أدوارا هامة في بيولوجيا الخلايا الجذعية, بما في ذلك Wnt (موقع التكامل ذات الصلة wingless), TGF-β (تحويل عامل النمو بيتا), والقنفذ1. ولكن من الصعب إثبات أن هذه المسارات هي محددة TIC واستخدام نشاط هذه المسارات لعزل TICs من الأورام الأولية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى علامة TIC رواية موثوق بها.
الإنسان MHC الفئة الأولى، وتسمى أيضا HLA-1، هو بروتين سطح الخلية أعرب في جميع الخلايا النووية تقريبا10. يعمل HLA-1 كمستضد يقدم جزيء يتم التعرف عليه على وجه التحديد من قبل خلايا CD8 T10. يمكن تنشيط تأثير الخلايا السامة للخلايا CD8 T عندما تقدم الخلايا السرطانية مستضد الورم بواسطة HLA-1. لذلك، عدم وجود HLA-1 على سطح الخلية من الخلايا السرطانية يمكن أن يؤدي إلى هروب المناعة من خلايا CD8 T السامة للخلايا. وقد تم وصف انخفاض تنظيم HLA-1 في أنواع مختلفة من السرطان البشري ويرتبط مع سوء التكهن، والنقيل، ومقاومة المخدرات11. لقد أظهرنا أن فقدان التعبير HLA-1 على سطح الخلية يمكن استخدامها لتحديد TICs في ساركوما، وكذلك في سرطان البروستاتا6،12.
هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل TICs من الساركوما البشرية PDXs من قبل FACS، وذلك باستخدام HLA-1 كعلامة سلبية، والمزيد من التحقق من صحة وتوصيف هذه HLA-1-السلبية TICs.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تحد من نجاح هذا البروتوكول لعزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما البشرية PDXs. لاحظنا أن تشكيل PDX يعتمد إلى حد كبير على الأنواع الفرعية ساركوما. ساركوما العدوانية السريرية مع النمط الظاهري غير المتمايز النسيجي (على سبيل المثال، ساركوما غير متمايزة pleomorphic [معدل النجاح 100٪، ن = 2]، الساركوما الشحمية غير المتمايزة [معدل النجاح 100٪، ن = 2]، وساركوما الزليلي [ معدل النجاح 100٪، ن = 3]) لديها معدل نجاح عال من تشكيل PDX. وفي الوقت نفسه، ساركوما مع الأنماط الظاهرية المتمايزة (على سبيل المثال، الساركوما الشحمية المتمايزة بشكل جيد [معدل النجاح 0٪، ن = 3]) تظهر معدلات تشكيل PDX أقل. من الممكن أن تكون الخلايا التي تبدأ الورم موجودة في أنواع فرعية أكثر خبيثة بنسبة مئوية أعلى مما كانت عليه في الأنواع الفرعية الأقل الخبيثة والمتباينة. وبالإضافة إلى ذلك، نوصي بالانتهاء من إجراء عزل الخلايا التي تبدأ الورم في غضون يوم واحد دون أي توقف لتقليل أي فقدان لوجدية الخلية.
لقد حددنا أن الخلايا السالبة HLA-1 موجودة على نطاق واسع في ساركوما الإنسان. ولكن النسبة المئوية للخلايا السلبية HLA-1 يمكن أن تختلف بين عينات من مرضى مختلفين. من خلال هذه الطريقة، قمنا بنجاح بعزل الخلايا التي تبدأ الورم من العينات التي لديها خلايا سلبية HLA-1 تتراوح بين أقل من 0.5٪ إلى أكثر من 30٪12. من المهم أن تميز الخلايا السالبة HLA-1 وظيفيا من خلال تشكيل الكرة والاختبارات تشكيل الورم لتأكيد هوية الخلية التي تبدأ الورم من الخلايا المعزولة HLA-1-السلبية.
ومع ذلك، فإن البروتوكول المعروض هنا له أيضا ً قيود. وأظهرت البيانات السابقة أن التعبير HLA-1 يتم تنظيمها جينيا، وهو ما يتفق مع ملاحظة التغاير الخلوي التعبير HLA-1 داخل نفس الورم12. تم الكشف عن طفرات جينية HLA-1 في ساركوما وأنواع السرطان الأخرى. الطفرات في جينات HLA-1 قد تؤدي إلى فقدان كامل من HLA-1 على سطح الخلية في الورم كله أو للتعبير عن غير وظيفية تغيير HLA-1. في كلتا الحالتين، لا يمكن استخدام سلبية HLA-1 لتحديد TICs داخل الورم.
باستخدام HLA-1 كعلامة سلبية، نجحنا في عزل TICs عن مجموعة متنوعة من الأنواع الفرعية للساركوما البشرية والتحقق من صحة نتائجنا من خلال التحليل الوظيفي. وهكذا، تمكنا من إجراء دراسات جزيئية بما في ذلك تحليل التعبير الجيني على TICs، من أجل تطوير علاج محدد يستهدف هذه المراكز.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا البحث من قبل NCI-P01-CA087497 (إلى C.C.-C. وD.H.) وNIH-U 54-0OD020353 (إلى C.C.-C., D.H., و J.D.-D.), جائزة قائد الفكر Agilent (إلى C.C.-C.), ومؤسسة مارتيل (إلى C.C.C.C.and J.D.-D.).
Materials
| 0.2 μm cell culture filter | ThermoFisher | 450-0020 | |
| 100 mm Petri dish | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tube | Falcon | 352196 | |
| 35 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL polystyrene tube | Falcon | 352070 | |
| 96-well ultra-low attachment cell culture plate | Corning | 7007 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| B-27 | Gibco | 08-0085SA | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0021 | |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| HLA-1-PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| hMSC growth medium | ATCC | PCS-500-030 | |
| indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| isobutylmethylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Isotype Control Antibody | Abcam | ab103534 | |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| lithium chloride | Sigma-Aldrich | 62476 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| MEM Alpha | Gibco | 12571-063 | |
| N2 | Gibco | 17502-048 | |
| NSG mice | The Jackson Lab | 005557 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Syringe with needle | BD | 309626 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
- Medema, J. Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).
- Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. Cancer stem cells. The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).
- Jordan, C. Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?. Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).
- Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
- Charafe-Jauffret, E. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).
- Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Yi, J., et al. Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors. Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).
- Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Garrido, F., et al. Natural history of HLA expression during tumour development. Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).
- Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions. Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).
- Han, D., et al. Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy. Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).
