肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

ここで議論されたマウス実験のためのすべてのプロトコルは、機関ガイドラインに従って、マウントシナイ医療センター機関人間研究倫理委員会と動物ケアと使用委員会によって承認されました。 1. 肉腫組織試料の処理とPDX形成 機関審査委員会が承認したプロトコルの下で、病理学サービス担当者が手術標本から肉腫サンプルを準備し、直ちに100mmペトリ皿の氷の上に各サンプルを置く。 15 mLポリスチレン円錐管にサンプルを入れ、10%の胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した冷たいロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培養培地の6 mLを用いた。組織サンプルを直ちに処理します。 (オプション)骨肉腫のみの場合は、軟部組織肉腫のためにスキップすることができる次の手順に従ってください。 メスを使ってティッシュを20mm3に切ります。コラゲナーゼ溶液の3 mLを含む15 mLチューブ(1mg/mLコラゲナーゼを有するRPMI 1640)に組織片を移す。 30分間37°Cの水浴にチューブを入れます。 チューブを徹底的に渦にし、次に、コラゲナーゼ活性を中和するために10Sを補充したRPMI 1640の3 mLを添加する。 室温で350 x gで5分間遠心分離機。上清を取り除く。 滅菌バイオセーフティキャビネットで作業し、100 mmペトリ皿に組織サンプルを置きます。無菌1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の500 μLを組織に加えます。滅菌メスを使用して、目に見えるティッシュ片が0.1mmより大きくなるまで、組織を機械的に小片にトリチュレートします。 500 μLセルサスペンションを35μmセルストレーナーに移し、50 mLポリスチレンチューブで濾過した懸濁液を回収します。この50 mLポリスチレンチューブを氷の上にセルサスペンションを入れてください。 組織にさらに500 μLのPBSを加えます。2回目のトリチュレートは、セルストレーナーを介して懸濁液を移し、同じ50mLチューブに集める。 組織セクションが完全に解離されるまで、これらのステップ(ステップ1.5-1.6)を繰り返し、通常は6x – 8x。 室温で10分間350xgで遠心分離による細胞懸濁液をペレットする。上清を廃棄し、5 mLの解血バッファー(0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3、および0.1 mM EDTA)を使用してペレットを再懸濁し、赤血球を除去するために室温で5分間溶液をインキュベートする。 室温で350 x gで5分間遠心分離機を使用し、熱化バッファーを除去します。5 mLのPBSでペレットを洗浄します。350 x gで5分間遠心分離機を再び取り除き、上清を取り除きます。 PBSの1 mLでペレットを再ステージングし、ヘモサイトメーターまたはその他の代替方法を使用して生存細胞数をカウントします。細胞を200μLのPBSで1 x 107細胞の最終濃度に希釈する。セルサスペンションを氷の上に置いておきます。 地下膜マトリックスを氷の上に置いて溶かします。200 μL細胞懸濁液に200 μLの地下膜マトリックスを追加します。ゆっくりと混ぜて氷の上に置いてください。 細胞懸濁液:基基膜マトリックス(1:1)混合物を2匹のNODサイッドガンマ(NSG)マウスの側面に皮下に注入する。注入ごとに 200 μL を使用します。 マウスの注射部位を週2回確認してPDX形成を監視する。直径1cmに達したら腫瘍異種移植片を取り除く。 2. PDXからのFACSによる腫瘍始動細胞の分離 前述の12に記載されているように、マウスからPDXを外科的に取り除く。 腫瘍を半分に切って一晩4%のパラホルムアルデヒドで異種移植片の半分を固定します。これは組織学的分析のためです。上記のように組織の残りの半分を処理し(ステップ1.3-1.8)腫瘍細胞懸濁液を得る。 PBSでペレットを再中断し、実行可能なセル番号をカウントします。 5Sを補充したPBS中の細胞懸濁液を2 x 106細胞/mLの濃度に希釈する。細胞懸濁液を氷の上に30分間放置し、2本のチューブにセル懸濁液を割ります。同位体制御と抗体でチューブをマークします。各チューブ内のセル数に注意してください。 5S(1:250)を補充したPBSで抗体を希釈して2x HLA-1-PE抗体を調製する。同じ条件で陰性アイソタイプコントロール抗体を希釈する。「抗体」チューブから希釈抗体(1:1)と細胞懸濁液を混合し、最終的な抗体希釈を1:500にします。同位数制御(1:1)と「同位板制御」チューブからセル懸濁液を混ぜます。セルサスペンションを氷の上に90分間置き、その場に置き下ろします。 4°Cで350 x gで5分間遠心分離機を取り除き、上清を取り除きます。ペレット2xを洗浄するためにPBSの10 mLを追加します。 PBSに4′,6-6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI)を10μg/mLの最終濃度に加えます。このDAPI溶液をセルペレットに追加し、107細胞/mLの細胞懸濁液を作ります(ステップ2.4からの細胞番号を使用)。 35 μm ストレーナーキャップを通してセルサスペンションを12 mm x 75 mm ポリスチレンチューブにフィルタリングします。 フローサイトメーターを使用して、HLA-1 陰性 TIC サブ母集団6をソートします。ゲート生存細胞(DAPI陰性)とHLA-1陰性および-陽性の両方のサブ集団を2つの15 mL回収管に集め、それぞれRPMI 1640培養培地の4mLを含む。 3. 腫瘍始発細胞の特性 サルコスフィア形成 α-MEM細胞培養培地を用いてサルコスフェア増殖培地を作る。B-27サプリメント(1x)、N2サプリメント(1x)、基本線維芽細胞増殖因子(bFGF)(20 ng/mL)、表皮成長因子(EGF)(20 ng/mL)およびペニシリン/ストレプトマイシン(100 IU/mL)の最終濃度を作るためにサプリメントを追加します。使用前に0.2 μmの細胞培養フィルターで培地を濾過します。 ステップ2.9から並べ替えられたHLA-1陰性および-正のサブ母集団をペレットし、各サブ母集団の細胞数をカウントする。 1.5 x 106細胞をサルコ球増殖培地の15mLに希釈し、1 x 105細胞/mLの細胞希釈を行う。 新鮮なサルコ球増殖培地で細胞を連続的に希釈し、10 4、103、および102細胞/mLの各細胞希釈の15mLを作る。次に、4枚の96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートを調製し、それぞれ細胞希釈用に用いる。 10 5細胞/mL希釈から最初の96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートの各ウェルに100μLの細胞懸濁液を移します。このプレートは、各井戸に104細胞を有する。 他の3つの細胞希釈に対して、他の3つの96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートを使用します:10 4、103、および102細胞/mL。96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートの各ウェルに100μLの細胞懸濁液を移します。これらの3つの培養プレートは、それぞれ1,000細胞/ウェル、100細胞/ウェル、および10細胞/ウェルを持っています。 プレートを37°C、5%CO2細胞培養インキュベーターに入れます。 新しいbFGFおよびEGFを細胞培養培地(20ng/mLの最終濃度)に3日ごとに直接加え、懸濁培養中に失われた細胞を避けるために培地を変えることなく。 光顕微鏡を使用して、図2Aに示すように、毎日3週間サルコ球形成を監視する。 3週間後、HLA-1陰性およびHLA-1陽性細胞の両方の各細胞希釈のサルコ球陽性ウェルとサルコスフェア陰性ウェルの数をカウントします。 ポアソン確率分布13に基づいて球形成細胞周波数を計算する。HLA-1 陰性の TIC を HLA-1 陽性バルクセルと比較します。 シリアル希釈腫瘍形成アッセイ 手順 2.9 から HLA-1 負および -正の亜集団をカウントします。 PBSを有する細胞の連続希釈を10 6、10 5、104、および103細胞/mLの濃度にする。10匹のマウスにおける腫瘍形成に各希釈の1mLを使用する。 各希釈の1mL細胞懸濁液に基塩膜マトリックスの1mLを加える(1:1)。各混合物の2 mLを氷の上に保管してください。 細胞の200 μLを皮下に注入する:NGSマウスの側面に基基基膜マトリックス混合物を注入し、同じマウスのもう一方のフランクに対してHLA-1陰性細胞およびHLA-1陽性細胞を用いた。希釈ごとに、10匹のマウスを使用する。注射用の針で25G注射器を使用してください。 腫瘍の増殖速度に応じて、マウスの腫瘍形成を4~8週間モニタリングする。 異なる入力細胞数における腫瘍形成のパーセンテージによって腫瘍を始動する細胞頻度を計算する。HLA-1 陰性の TIC を HLA-1 陽性バルクセルと比較します。 間葉系経路に沿った誘導分化 前の手順で形成されたサルコスフィアを使用します(ステップ 3.1.9)。サルコスフィアを新しい6ウェルプレートに移します。2.5mLのα-MEMを用いたサルコスフェアを10Sで培養し、細胞を培養板表面に付着させる。 2日間の添付ファイルの後、培養培地を10Sで補充したα-MEMから10Sおよびヒト間葉系幹細胞(hMSC)増殖培地で補充されたα-MEMの1:1混合物に切り替える。 2 日後、完全な hMSC 成長培地に切り替えます。 細胞が90%の合流に達したら、hMSC培地を吸引し、分化培地を加える。骨原分化のために、骨原分化培地(hMSC増殖培地に10nMデキサメタゾン、5mMβ-グリセロリン酸、50μg/mL L-アスコルビン酸、および10mM塩化リチウムを添加する)を加える。脂肪原分化のために、脂肪細胞分化培地(hMSC増殖培地は0.5 μMデキサメタゾン、0.5 μMイソブチルメチルキサンチン、および50μMのインドメタシンを添加する)を追加する。 分化媒体を3日ごとに変更します。 3〜4週間後、分化を停止し、PBSで細胞を洗浄します。次いで、PBSを吸引し、10%ホルマリンの2mLを細胞に加えて固定する。細胞を室温で45分間座らせます。脱イオン水で洗う。アリザリンレッドS染色(ステップ3.3.6.1)またはオイルレッドO染色(ステップ3.3.6.2)の準備が整いました。 骨原分化を検出するには、アリザリンレッドS染色を行います。水を吸引し、アリザリンレッドS作動溶液(2%アリザリンレッドS、pH 6.0)を細胞に2mL加え、染色のために5分間座らせます。脱イオン水で細胞を洗浄し、顕微鏡で反応を観察します。 脂肪原性分化を検出するには、オイルレッドO染色を行います。 オイルレッドO溶液を作ります。イソプロパノールの100 mLにオイルレッドO粉末の300mgを添加することにより、ストック溶液を調べます。 使用前の2時間以内に、脱イオン水の2つの部分(20 mL)でオイルレッドOストック溶液の3つの部品(30 mL)を混合します。混合物が室温で10分間座るようにします。 使用前に作業ソリューションをフィルタリングします。 ステップ3.3.6に従って調製した細胞から水を取り除きます。60%イソプロパノールの2mLを加えて細胞単層を覆い、細胞は2分間座る。 イソプロパノールを取り出し、オイルレッドO作動液を2mL加えます。細胞が室温で5分間座るようにします。 脱イオン水で細胞をすすいで、光顕微鏡で反応を観察します。