בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

כל הפרוטוקולים לניסויי העכבר שנדונו כאן היו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על-ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי בהר סיני, וועדת הבריאות והשימוש בבעלי חיים. 1. עיבוד של דגימת רקמות סרקומה, ו PDX היווצרות תחת הלוח סקירה מוסדית-פרוטוקול מאושר, יש אנשי שירות פתולוגיה להכין דגימות סרקומה מדגימות ניתוח ומיד לשים כל מדגם על הקרח בצלחת פטרי 100 מ”מ. מניחים את המדגם לתוך 15 מ ל פוליסטירן מוקצף עם שפופרת 6 מ ל של הקרה ברוזוול פארק הזיכרון המכון (RPMI) 1640 תרבות בינונית בתוספת של 10% סרום בצורת העובר (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. . תעבד את דגימת הרקמה מיד אופציונלי עבור אוסטאוסרקומה בלבד, בצע את השלבים הבאים, אשר ניתן לדלג על סרקומה רקמות רכות. חותכים את הרקמה 20 מ”מ3 חתיכות באמצעות אזמל. העבר את חתיכות הרקמה לצינור 15 מ”ל המכיל 3 מ ל של התמיסה הקולגן (RPMI 1640 עם 1 מ”ג/mL קולגן). הכניסו את הצינור לאמבט מים ב-37 ° c למשך 30 דקות. ביסודיות מערבולת הצינור, ולאחר מכן, להוסיף 3 מ ל של RPMI 1640 שיושלם עם 10% FBS לנטרל את הפעילות הקולגן. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g בטמפרטורת החדר. . הסר את הסופרנטאנט לעבוד בארון ביולוגי סטרילי, למקם את דגימת הרקמה בצלחת פטרי 100 מ”מ. הוסף 500 μL של תמיסת מלח מאגור באגירה 1 x פוספט (PBS) לרקמה. עם אזמל סטרילי, קצוצות מכנית הרקמה לחתיכות קטנות עד שום פיסת רקמות נראה גדול יותר מ 0.1 מ”מ. העבר את ההשעיה של התא 500 μl אל מסננת תא 35 יקרומטר ולאסוף את ההשעיה מסוננים עם שפופרת קלקר 50 mL. הניחו את הצינורית ה50 mL עם ההשעיה של התא על הקרח. הוסף עוד 500 μL של PBS לרקמות. Triturate בפעם השנייה, להעביר את ההשעיה דרך מסננת התא, ולאסוף אותו לתוך אותו צינור 50 mL. חזור על שלבים אלה (שלבים 1.5 – 1.6) עד מקטע הרקמה הוא הנתק לחלוטין, בדרך כלל 6x-8x. גלולה ההשעיה התא ידי צנטריפוגה ב 350 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את הגלולה באמצעות 5 מ ל של מאגר המוליזה (0.15 M NH4Cl, 10 מ”מ khco3, ו 0.1 מ”מ edta), ו דגירה את הפתרון עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר כדוריות הדם האדומות. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g בטמפרטורת החדר ולהסיר את מאגר המוליזיס. רחץ את הגלולה עם 5 מ ל של PBS. צנטריפוגה שוב עבור 5 דקות ב 350 x g ולהסיר את supernatant. השהה מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של PBS ולספור את מספר התא קיימא באמצעות הומוציטוטומטר או כל שיטה חלופית אחרת. לדלל את התאים לריכוז הסופי של 1 x 107 תאים ב 200 ΜL של PBS. . תשאיר את ההשעיה של התא על הקרח להשאיר את מטריצת הממברנה במרתף על הקרח כדי לאפשר לו להמיס. הוסף 200 μL של מטריצת קרום המרתף להשעיה של התאים 200 μL. לערבב בעדינות ולשמור על קרח. תת-עורי להזריק את ההשעיה התא: מטריצה קרום המרתף (1:1) התערובת לתוך שני בהנהון scid גמא (NSG) העכברים לתוך האגפים שלהם. השתמש ב-200 μL עבור כל זריקה. נטר את היווצרות PDX על-ידי בדיקת אתר ההזרקה של העכברים 2x בשבוע. הסר את השתל מבע גידול כאשר הוא מגיע 1 ס מ קוטר. 2. בידוד של הגידול-מאתחל תאים על ידי FACS מ-PDX הסר את ה-PDX מהעכברים כפי שמתואר קודם לכןב-12. . תחתוך את הגידול לחצי לתקן חצי של השתל עם 4% פאראמפורמלדהיד בלילה. . זה בשביל ניתוח היסטולוגית לעבד את החצי השני של הרקמה כמתואר לעיל (שלבים 1.3 – 1.8) כדי לקבל השעיה תא הגידול. . ותספור את מספר התא האפשרי לדלל את ההשעיה התא ב-PBS בתוספת עם 5% FBS לריכוז של 2 x 106 תאים/mL. להשאיר את ההשעיה התא על קרח 30 דקות. חלק את ההשעיה התא מעל שתי שפופרות. סמן את החצוצרות בעזרת. בקרת איזוטופ ונוגדן, בהתאמה שים לב למספר התאים בכל צינורית. להכין 2x HLA-1-PE נוגדן על ידי דילול הנוגדן עם PBS בתוספת עם 5% FBS (1:250). לדלל את הנוגדן בקרת איזוטיפ שלילי עם אותו מצב. לערבב את ההשעיה התא מן הצינור “נוגדן” עם נוגדנים מדולל (1:1) כדי להפוך את הנוגדן הסופי דילול 1:500. ערבב את ההשעיה של התא מצינור “שליטת איזוטופ” עם בקרת איזוטופ (1:1). שים את השעיות התאים על קרח עבור 90 דקות. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 350 x g ב 4 ° c ולהסיר את הסופרנטאנט. הוסף 10 מ ל של PBS לשטוף את 2x גלולה. הוסף 4 ‘, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) כדי PBS לריכוז הסופי של 10 μg/mL. הוסף פתרון DAPI זה לגלולה התא כדי ליצור השעיית תא של 107 תאים/mL (באמצעות מספרי התאים משלב 2.4). לסנן את ההשעיה התא דרך 35 יקרומטר כמוסות מסננת לתוך 12 מ”מ x 75 מילימטר מצינורות פוליסטירן. השתמש cytometer זרם כדי למיין את HLA-1-שלילי TIC אוכלוסיית המשנה6. השער תאים קיימא (DAPI-שלילי) ולאסוף את שני אוכלוסיות HLA-1-שלילי ו-חיובי לתוך 2 15 mL אוסף צינורות, כל אחד המכיל 4 מ ל של RPMI 1640 תרבות בינונית. 3. אפיון הגידול בתאים מתחילים מבנה Sarcosphere להפוך sarcosphere בינונית צמיחה, באמצעות מדיום התרבות תא אלפא. הוסף תוספי מזון כדי להפוך את הריכוז הסופי של תוספי B-27 (1x), N2 תוספי מזון (1x), מקדם הצמיחה פיברופיצוץ בסיסי (bFGF) (20 ng/mL), ומקדם צמיחה עוריות (EGF) (20 ng/mL) ו פניצילין/סטרפטומיצין (100 IU/mL). סנן את המדיום באמצעות מסנן תרבות תא מ0.2 יקרומטר לפני השימוש. מצנעה את האוכלוסיה המויינת HLA-1-שלילית וחיובית משלב 2.9 וסופרת את מספרי התאים של כל אחד מאוכלוסיית המשנה. לדלל 1.5 x 106 תאים לתוך 15 מ ל של בינוני גדילה sarcosphere כדי להפוך את הדילול התא של 1 x 105 תאים/mL. סרילית לדלל את התאים עם sarcosphere טרי צמיחה בינונית כדי להפוך 15 מ ל של כל דילול התא של 104, 103, ו 102 תאים/mL. אז, להכין 4 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף לוחיות התרבות התא, כל אחד עבור דילול התא. העבר 100 μL של השעיית תא מתוך 105 תאים/לדילול כל הטוב של הראשון 96-ובכן אולטרה מצורף הקובץ המצורף לצלחת התרבות. צלחת זו יש 104 תאים בכל טוב. השתמש השני 3 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף לוחות תרבות תא עבור שלושת התאים האחרים: 104, 103, ו 102 תאים/mL. העבר 100 μL של השעיית התא לכל טוב של 96-ובכן אולטרה מצורף לוחיות הזיהוי של התרבות התא. אלה שלוש לוחיות התרבות יש 1,000 תאים/ובכן, 100 תאים/טוב, ו 10 תאים/ובכן, בהתאמה. הכניסו את הלוחות לתוך 37 ° c, 5% חממה לתרבית תאים. להוסיף bFGF ו EGF חדש ישירות למדיום תרבות התא (ריכוז סופי של 20 ng/mL) כל שלושה ימים מבלי לשנות את המדיום כדי למנוע תאים אבודים בתרבות ההשעיה. באמצעות מיקרוסקופ קל, מפקחים על היווצרות הsarcosphere מדי יום במשך שלושה שבועות, כפי שמוצג באיור 2A. לאחר שלושה שבועות, ספור את מספר הבארות הsarcosphere והבארות הsarcosphere-שליליות של כל דילול התא עבור תאים שליליים ו-hla-1-שלילי ו-HLA-1-חיוביים. חישוב תדר התא היוצר את הספירה בהתבסס על התפלגות ההסתברות של פואסון13. השווה את הטיקים HLA-1-שלילי עם התאים הגורפת HLA-1-חיוביים. שיטת גידול בדילול סדרתי ספור את אוכלוסיית המשנה HLA-1-שלילית וחיובית משלב 2.9. להפוך דילול סדרתי של התאים עם PBS לריכוזים של 106, 105, 104, ו 103 תאים/mL. השתמש 1 mL של כל דילול עבור היווצרות הגידול ב 10 עכברים. הוסף 1 מ ל של מטריצה קרום המרתף 1 mL השעיית התא של כל דילול (1:1). שמור את 2 מ ל של כל תערובת על הקרח. תת-עורי להזריק 200 μL של התא: מטריצה מרתף ממברנה תערובת לתוך מאגפים של עכברים NGS, באמצעות HLA-1-תאים שליליים עבור אגף אחד ותאים HLA-1-חיובי עבור האגף השני של העכבר אותו. עבור כל דילול, השתמש 10 עכברים. השתמש מזרקים 25G עם מחט עבור הזריקות. ניטור היווצרות הגידול בעכברים במשך ארבעה עד שמונה שבועות, בהתאם לקצב צמיחת הגידול. חישוב תדר התא היוזם הגידול על ידי אחוז היווצרות הגידול במספרים שונים תא קלט. השווה את הטיקים HLA-1-שלילי עם התאים הגורפת HLA-1-חיוביים. בידול מושרה לאורך מסלולים של המסכמצ’אל השתמש בsarcospheres שנוצרו במהלך השלבים הקודמים (שלב 3.1.9). העבירו את הsarcospheres. לצלחת 6-טוב חדשה תרבות הsarcosphere עם 2.5 mL של אלפא-מגברתי בתוספת עם 10% FBS כדי לאפשר לתאים לצרף למשטח התרבות. לאחר החזקה במשך יומיים, להחליף את מדיום התרבות מ-alpha-הגברת שיושלם עם 10% FBS לתערובת 1:1 של אלפא מגברת בתוספת עם 10% FBS ו-האנושי mesenchymal תא גזע (hMSC) גידול בינוני. לאחר יומיים, עבור להשלמת הצמיחה hMSC בינונית. כאשר התאים מגיעים 90% השטף, להפיח את המדיום hMSC ולהוסיף בינוני. עבור בידול אוסטגניים, להוסיף הבחנה אוסטגניים בינונית (hMSC בינונית צמיחה שיושלם עם 10 ננומטר dexamethone, 5 מ”מ β-glycerophosphate, 50 μg/mL-חומצה אסקורבית, ו 10 מ”מ ליתיום כלוריד). עבור בידול ליפוגני, להוסיף אדיפוציט בידול בינוני (hMSC בינונית צמיחה בתוספת עם 0.5 μM dexamethone, 0.5 μM isoבוטיליקסאת, ו 50 μM indomethacin ו). לשנות את מדיום בידול כל שלושה ימים. לאחר שלושה עד ארבעה שבועות, להפסיק את הבידול ולשטוף את התאים עם PBS. לאחר מכן, משף את הערוץ ומוסיף 2 מ ל 10% פורמלין לתאים עבור קיבעון. תנו לתאים לשבת 45 דקות בטמפרטורת החדר. רוחצים אותם במים מפוהים. התאים עכשיו מוכנים אליזרין אדום הצביעת (שלב 3.3.6.1) או שמן כתמים Red O (שלב 3.3.6.2). כדי לזהות בידול אוסטגניים, לבצע כתמים של אליזרין אדום. מכתים מים ומוסיפים 2 מ ל של הפתרון העובד האדום של אליזרין (2% Aliזרין אדום, pH 6.0) לתאים, ולתת להם לשבת 5 דקות לצביעת. רוחצים את התאים במים מפוהים ורואים את התגובה המיקרוסקונית. כדי לזהות בידול אדיפוגני, לבצע כתמים שמן אדום O. לעשות פתרון שמן אדום או. הכנת פתרון מניות על ידי הוספת 300 מ”ג של אבקת שמן אדום O ל 100 mL של איזופנול. בתוך 2 h לפני השימוש, מערבבים שלושה חלקים (30 mL) של פתרון מניות של שמן אדום O עם שני חלקים (20 מ ל) של מים מוהים. אפשר לתערובת לשבת 10 דקות בטמפרטורת החדר. סנן את פתרון העבודה באמצעות לפני השימוש. להסיר את המים מן התאים שהוכנו על פי שלב 3.3.6. הוסף 2 מ ל של 60% איזופנול כדי לכסות את תא מונאולייר ואת התאים לשבת 2 דקות. להסיר את האיזופנול ולהוסיף 2 מ ל של שמן אדום O פתרון עבודה. אפשר לתאים לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים במים מפוהים וצפו בתגובה שמתחת למיקרוסקופ אור.