Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

Burada tartışılan fare deneylerinin tüm protokolleri, kurumsal yönergelere uygun ve Mount Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Insan araştırma etiği Komitesi ve hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. sarkom doku numunesi ve PDX oluşumunun işlenmesi Bir kurumsal Inceleme kurulu onaylı protokol altında, patoloji servis personeli cerrahi örneklerden sarkom örnekleri hazırlamak ve hemen bir 100 mm Petri çanak buz üzerine her örnek koydu. Örnek bir 15 mL polistiren konik tüp içine 6 mL soğuk Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMı) 1640 kültür orta% 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 1% penisilin/streptomisin ile desteklenmektedir. Doku örneğini hemen işleme atın. Isteğe bağlı Sadece osteosarkom için, yumuşak doku sarkomu için atılabilir aşağıdaki adımları izleyin. Bir neşter kullanarak 20 mm3 adet içine doku kes. Doku parçalarını 3 ml kolagenaz çözeltisi (1 mg/ml kolajenaz ile RPMI 1640) içeren 15 ml ‘lik bir tüpe aktarın. Tüpü 30 dakika boyunca 37 °C ‘ de bir su banyosuna koyun. İyice boru girdap ve sonra, eklemek 3 RPMI 1640 ml 10% FBS ile tamamlayıcı kolajenaz etkinliğini nötralize etmek. 350 x g ‘de oda sıcaklığında 5 dk Santrifüjü. Süpernatant çıkarın. Steril Biyogüvenlik kabininde çalışma, doku örneğini 100 mm Petri tabağı içine yerleştirin. 500 ekleme μL steril 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) dokusuna. Steril bir neşter ile, hiçbir görünür doku parçası 0,1 mm ‘den büyük olana kadar mekanik olarak dokuyu küçük parçalara ayırmaya çalışmaktadır. 500 μL hücreli süspansiyonu 35 μm hücreli bir filtreye aktarın ve filtrelenmiş süspansiyonu bir 50 mL polistiren tüpü ile toplayın. Bu 50 mL polistiren tüp buz üzerinde hücre süspansiyon ile koyun. Dokuya başka bir 500 μL PBS daha ekleyin. Triturate ikinci kez, hücre süzgeci aracılığıyla süspansiyon transferi ve aynı 50 mL tüp içine toplamak. Doku bölümü tamamen dissociated kadar, genellikle 6x-8X bu adımları (1,5 – 1,6 adımlar) tekrarlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika 350 x g santrifüjleme ile hücre süspansiyonu Pellet. Supernatant atın, 5 ml hemoliz tampon kullanarak Pelet pelletini (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3, ve 0,1 mm EDTA), ve kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için oda sıcaklığında 5 dakika için çözüm inkük. 350 x g ‘de oda sıcaklığında 5 dakika Santrifüjü ve hemoliz tamponunu çıkarın. 5 ml PBS ile Pelet yıkayın. 350 x g ‘de 5 dakika boyunca tekrar santrifüjün ve süpernatant çıkarın. 1 ml PBS ile Pelet resuspend ve bir hemasitometre veya başka bir alternatif yöntem kullanarak uygun hücre numarasını saymak. 200 μL PBS ‘de 1 x 107 hücrelerin son konsantrasyonuna hücreleri seyreltin. Hücre süspansiyonunu buzun üzerine bırakın. Bodrum membranı matrisini buzun üzerine bırakıp erimesine izin verin. 200 μL hücreli süspansiyona 200 μL Bodrum membran matrisini ekleyin. Yavaşça karıştırın ve buz üzerinde tutun. Subkutan hücre süspansiyon enjekte: Bodrum membran matris (1:1) karışımı İki nod SCID Gama (NSG) fareler içine onların kanatlarını içine. Her enjeksiyon için 200 μL kullanın. Bir hafta 2x fareler enjeksiyon site kontrol ederek PDX oluşumu izleyin. 1 cm çapı ulaştığında tümör xenograft çıkarın. 2. tümör yalıtım-PDX gelen FACS tarafından hücreleri başlatma Önceki12’ de açıklandığı şekilde PDX ‘i farelerden cerrahi olarak kaldırın. Tümörü ikiye keselim. Bir gecede% 4 civarında formaldehite ile xenograft yarısını düzeltin. Bu histolojik analiz için. Bir tümör hücresi süspansiyon almak için yukarıda açıklandığı gibi doku diğer yarısını (adımlar 1.3 – 1.8) işlem. PBS ile Pelet resuspend ve geçerli hücre numarasını saymak. PBS ‘deki hücre süspansiyonunu, 2 x 106 hücreli/ml konsantrasyonuna% 5 FBS ile tamamlayıcı olarak seyreltin. Hücre süspansiyonunu 30 dakika boyunca buzda bırakın. hücre süspansiyonunu iki tüpün üzerine bölün. Tüplerin iZotope kontrolü ve antikor ile işaretlemek, sırasıyla. Her tüpteki hücre sayısını not alın. 5% FBS (1:250) ile tamamlayıcı PBS ile antikor seyreltilerek 2x HLA-1-PE antikor hazırlayın. Aynı koşulla negatif izotip kontrol antikor seyreltmeli. Son antikor seyreltme 1:500 yapmak için seyreltilmiş antikor (1:1) ile “antikor” tüp hücre süspansiyon karıştırın. Hücre süspansiyonunu izotop kontrolü (1:1) ile “iZotope kontrol” tüpünden karıştırın. 90 dk için buz üzerinde hücre süspansiyonları koyun. 4 °C ‘ de 350 x g ‘de 5 dakika santrifüjün ve süpernatant çıkarın. Pelet 2x yıkamak için PBS 10 ml ekleyin. 10 μg/mL ‘Lik son konsantrasyona PBS ‘ye 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ekleyin. Bu DAPI çözüm hücre Pelet 107 hücreler/ml (adım 2,4 hücre numaralarını kullanarak) bir hücre süspansiyonu yapmak için ekleyin. 12 mm x 75 mm polistiren tüplere 35 μm süzgeç kapakları aracılığıyla hücre süspansiyonunu filtreleyin. HLA-1-negatif TIC alt nüfus6sıralamak için bir akış sitometresi kullanın. Kapı uygun hücreler (DAPı-negatif) ve her iki HLA-1-negatif ve pozitif altnüfus 2 15 mL toplama tüpleri içine toplamak, her 4 mL RPMı 1640 kültür orta içerir. 3. tümör-başlatma hücrelerinin karakterizasyonu Sarcosphere oluşumu Alfa-MEM hücre kültürü orta kullanarak sarcosphere büyüme orta olun. B-27 takviyeleri (1x), N2 takviyeleri (1x), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) (20 ng/mL) ve Epidermal büyüme faktörü (EGF) (20 ng/mL) ve penisilin/streptomisin (100 ıU/mL) son konsantrasyon yapmak için takviyeleri ekleyin. Kullanmadan önce 0,2 μm hücreli kültür filtresine sahip ortamı filtreleyin. Sıralı HLA-1-negatif ve pozitif alt nüfus adım 2,9 ve her alt nüfus hücre numaralarını saymak Pellet. Seyreltme 1,5 x 106 hücreler Içine 15 ml sarcosphere büyüme orta hücre seyreltmesi yapmak için 1 x 105 hücreler/ml. Seri olarak, 104, 103ve 102 hücre/mL her hücre seyreltme 15 ml yapmak için taze sarcosphere büyüme orta hücreleri seyreltti. Sonra, hazırlamak 4 96-iyi Ultra-düşük ek hücre kültür plakaları, bir hücre seyreltme için her. Transfer 100 μL hücre süspansiyon 105 hücreler/ml seyreltme her iyi ilk 96-iyi Ultra-düşük ek hücre kültür plakası. Bu plaka her kuyunda 104 hücreye sahiptir. Diğer üç hücre seyreltme için diğer 3 96-Well Ultra-düşük ek hücre kültür plakaları kullanın: 104, 103, ve 102 hücreler/ml. 96-Well Ultra-düşük ek hücre kültürü plakalarının her bir kuyusu için 100 μL hücre süspansiyonu aktarın. Bu üç kültür plakaları 1.000 hücre/iyi, 100 hücre/iyi ve 10 hücre/iyi, sırasıyla var. Plakaları 37 °C,% 5 CO2 hücreli kültür inkükodiye yerleştirin. Hücre kültürü ortamına doğrudan yeni bFGF ve EGF ekleyin (son konsantrasyon 20 ng/mL) her üç günde bir ortam değiştirmeden süspansiyon kültüründe kayıp hücreleri önlemek için. Işık mikroskobu kullanarak, Şekil 2a’da gösterildiği gibi, üç hafta boyunca her gün sarkoküre oluşumunu izleyin. Üç hafta sonra, HLA-1-negatif ve HLA-1-pozitif hücreler için her hücre seyreltme sarcosphere-pozitif kuyular ve sarcosphere-negatif kuyuların sayısını saymak. Poisson olasılık dağılımı13temelinde küre oluşturan hücre sıklığını hesaplayın. HLA-1-negatif tikler HLA-1-pozitif toplu hücreler ile karşılaştırın. Seri-seyreltme tümörü-oluşum tahlil 2,9 adımda HLA-1-negatif ve pozitif alt nüfus saymak. 106, 105, 104ve 103 hücre/ml konsantrasyonları PBS ile hücrelerin seri dilüsyonları olun. 10 fareler içinde tümör oluşumu için her seyreltme 1 mL kullanın. Her seyreltme 1 mL hücreli süspansiyona 1 mL Bodrum membran matrisi ekleyin (1:1). Buz üzerinde her karışımı 2 mL tutun. Hücre 200 μL subkutan enjekte: NGS farelerin çevrelerine Bodrum membran matris karışımı, bir kanat için HLA-1-negatif hücreler ve aynı fare diğer tarafı için HLA-1-pozitif hücreler kullanılarak. Her seyreltme için 10 fare kullanın. Enjeksiyonlar için bir iğne ile 25G şırıngalar kullanın. Tümör oluşumu oranına bağlı olarak, dört ila sekiz hafta boyunca farelerde tümör oluşumunu izleyin. Farklı giriş hücresi numaralarının tümör oluşumu yüzdesi ile tümör başlatan hücre sıklığını hesaplayın. HLA-1-negatif tikler HLA-1-pozitif toplu hücreler ile karşılaştırın. Mezenkimal yollar boyunca indüklenen farklılaşma Önceki adımlarda oluşturulan sarcospheres kullanın (adım 3.1.9). Sarcospheres yeni bir 6-kuyu plaka aktarın. Kültür sarcosphere ile 2,5 mL Alfa-MEM ile tamamlayıcı 10% FBS hücreleri kültür plaka yüzeyine eklemek izin. İki gün için bir eki sonra, Alpha-MEM ile% 10 FBS ile% 10 FBS ve insan mesenkimal kök hücre (hMSC) büyüme orta ile tamamlayıcı Alfa-MEM 1:1 karışımı ile tamamlayıcı kültür ortamı geçiş. İki gün sonra, tam hMSC büyüme ortamına geçin. Hücreleri% 90 konfluency ulaştığında, hmsc orta Aspire ve farklılaşma ortamı ekleyin. Osteogenik farklılaşma için, osteogenik farklılaşma orta ekleyin (hMSC büyüme orta 10 nM dexametazon ile tamamlayıcı, 5 mM β-glisofosfat, 50 μg/mL L-askorbik asit, ve 10 mM Lityum klorür). Lipojenik farklılaşma için, adiposit farklılaşma orta ekleyin (hmsc büyüme orta 0,5 μm dexametazon ile tamamlayıcı, 0,5 μm isobutilmetilxanthine, ve 50 μm indometasin). Farklılaşma ortamını her üç günde bir değiştirin. Üç-dört hafta sonra, farklılaşma durdurun ve hücreleri PBS ile yıkayın. Sonra, PBS Aspire ve sabitleme için hücrelere% 10 formalin 2 ml ekleyin. Hücreler oda sıcaklığında 45 dakika otursun. Onları deiyonize suyla yıkayın. Hücreler artık alizarin Red S boyama (adım 3.3.6.1) veya Oil Red O boyama (adım 3.3.6.2) için hazırdır. Osteogenik farklılaşma algılamak için, alizarin kırmızı S boyama gerçekleştirin. Aspirate su ve 2 mL alizarin Red S çalışma çözeltisi ekleyin (2% alizarin kırmızı S, pH 6,0) hücrelere, ve onları boyama için 5 dakika oturup izin. Hücreleri deiyonize suyla yıkayın ve reaksiyonu mikroskobik olarak izleyin. Adipojenik farklılaşma tespit etmek için, yağ kırmızı O boyama gerçekleştirin. Bir yağ kırmızı O çözüm olun. 100 mL isopropanol için 300 mg yağ kırmızı O tozu ekleyerek bir stok çözüm hazırlayın. Kullanmadan önce 2 saat içinde, iki parça (20 mL) deiyonize su ile üç parça (30 mL) Oil Red O stok çözeltisi karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika oturmak için izin verin. Kullanım öncesinde kullanarak çalışma çözümünü filtreleyin. Adım 3.3.6 göre hazırlanan hücrelerden su çıkarın. Hücre tek tabakalı kapsayacak şekilde 2 ml 60% izopropanol ekleyin ve hücreler 2 dakika oturmak. İzopropanol çıkarın ve 2 ml yağ kırmızı O çalışma solüsyonu ekleyin. Hücrelerin oda sıcaklığında 5 dakika oturmasına izin verin. Hücreleri deiyonize su ile durulayın ve ışık mikroskobu altında reaksiyonu gözlemlemek.