Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

Alle protocollen voor muis experimenten hier besproken waren in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Mount Sinai Medical Center institutioneel menselijk onderzoek ethiek Commissie en Dierenzorg en gebruik Comité. 1. verwerking van het Sarcoom weefselmonster en PDX-vorming Onder een institutioneel Review Board-goedgekeurd protocol, hebben pathologie servicemedewerkers Sarcoom monsters van chirurgische specimens bereiden en onmiddellijk elk monster op ijs zetten in een 100 mm Petri schaaltje. Plaats het monster in een conische buis van 15 mL polystyreen met 6 mL Cold Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicileen/streptomycine. Het weefselmonster onmiddellijk verwerken. Optionele Voor Osteosarcoom alleen, volg de volgende stappen, die kunnen worden overgeslagen voor wekedelensarcoom. Snijd het weefsel in 20 mm3 stuks met behulp van een scalpel. Breng de weefsel stukken over in een buis van 15 mL die 3 mL Collagenase-oplossing bevat (RPMI 1640 met 1 mg/mL Collagenase). Zet de buis gedurende 30 minuten in een waterbad bij 37 °C. De buis grondig Vortex en voeg vervolgens 3 mL RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS om de Collagenase-activiteit te neutraliseren. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant. Werk in een steriele bioveiligheidskast en plaats het weefselmonster in een 100 mm Petri schaaltje. Voeg 500 μL steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan het weefsel. Met een steriel scalpel, mechanisch wrijf het weefsel in kleine stukjes totdat geen zichtbare weefsel stuk groter is dan 0,1 mm. Breng de 500 μL celsuspensie over in een celzeef van 35 μm en verzamel de gefilterde suspensie met een polystyreen buis van 50 mL. Plaats deze 50 mL polystyreen buis met de celsuspensie op ijs. Voeg nog eens 500 μL PBS aan het weefsel toe. Triturate voor de tweede keer, overdracht van de suspensie door de cel zeef, en verzamel het in dezelfde 50 mL buis. Herhaal deze stappen (stappen 1.5 – 1.6) totdat de weefsel sectie volledig is losgekoppeld, meestal 6x-8x. Pellet de celsuspensie door centrifugeren bij 350 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg, regeer de pellet met 5 mL hemolyse-buffer (0,15 M NH4cl, 10 mm khco3en 0,1 mm EDTA) en inbroed de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te verwijderen. Centrifugeer gedurende 5 min bij 350 x g bij kamertemperatuur en verwijder de hemolyse-buffer. Was de pellet met 5 mL PBS. Centrifugeer nogmaals gedurende 5 minuten bij 350 x g en verwijder het supernatant. Respendeer de pellet met 1 mL PBS en Tel het levensvatbare celgetal met behulp van een hemocytometer of een andere alternatieve methode. Verdun de cellen tot een uiteindelijke concentratie van 1 x 107 cellen in 200 μL PBS. Laat de celsuspensie op ijs. Laat de kelder membraan matrix op ijs zodat het smelt. Voeg 200 μL kelder membraan matrix toe aan de 200 μL celsuspensie. Zachtjes mengen en op ijs houden. Subcutaan injecteren de celsuspensie: kelder membraan matrix (1:1) mengsel in twee NOD scid gamma (NSG) muizen in hun flanken. Gebruik voor elke injectie 200 μL. Bewaak de PDX-formatie door de injectieplaats van de muizen 2x per week te controleren. Verwijder de tumor xenotransplantaatmodellen is wanneer het 1 cm in diameter bereikt. 2. isolatie van tumor-initiërende cellen door FACS van de PDX Verwijder chirurgisch de PDX van de muizen zoals eerder beschreven12. Snijd de tumor in tweeën. Bevestig de helft van de xenotransplantaatmodellen is met 4% Paraformaldehyde ‘s nachts. Dit is voor histologische analyse. Verwerk de andere helft van het weefsel zoals hierboven beschreven (stappen 1.3 – 1.8) om een tumor celsuspensie te krijgen. Respendeer de pellet met PBS en Tel het levensvatbare celnummer. Verdun de celsuspensie in PBS, aangevuld met 5% FBS tot een concentratie van 2 x 106 cellen/ml. Laat de celsuspensie 30 min op ijs liggen verdeel de celsuspensie over twee buisjes. Markeer de buizen met isotoop controle en antilichamen, respectievelijk. Noteer het aantal cellen in elke buis. Bereid 2 x HLA-1-PE antilichamen door het antilichaam te verdunen met PBS aangevuld met 5% FBS (1:250). Verdun het negatieve Isotype-controle-antilichaam met dezelfde toestand. Meng de celsuspensie uit de “antilichaam” buis met verdund antilichaam (1:1) om de uiteindelijke antilichaam verdunning 1:500 te maken. Meng de celsuspensie van de “isotoop controle” buis met isotoop regeling (1:1). Zet de celsuspensies op ijs voor 90 min. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij 4 °c en verwijder het supernatant. Voeg 10 mL PBS toe om de pellet 2x te wassen. Voeg 4 ‘, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) toe aan PBS tot een eindconcentratie van 10 μg/mL. Voeg deze DAPI-oplossing toe aan de celpellet om een celsuspensie van 107 -cellen/ml te maken (met behulp van de celnummers van stap 2,4). Filtreer de celsuspensie door middel van 35 μm zeef doppen in 12 mm x 75 mm polystyreen buizen. Gebruik een flow cytometer om de HLA-1-negatieve TIC subpopulatie6te sorteren. Gate levensvatbare cellen (DAPI-Negative) en verzamel zowel HLA-1-negatieve als positieve subpopulaties in 2 15 mL Verzamel buisjes, elk met 4 mL RPMI 1640 kweekmedium. 3. karakterisering van tumor-initiërende cellen Sarcosphere Formation Maak sarcosphere Growth medium met behulp van alpha-MEM Cell Culture medium. Voeg supplementen om een eindconcentratie van B-27 supplementen (1x), N2 supplementen (1x), basis fibroblast groeifactor (bFGF) (20 ng/mL), en epidermale groeifactor (EGF) (20 ng/mL) en penicillaire/streptomycine (100 IU/mL). Filtreer het medium met een celkweek filter van 0,2 μm voor gebruik. Pellet de gesorteerde HLA-1-negatieve en-positieve subpopulatie uit stap 2,9 en Tel de celaantallen van elke subpopulatie. Verdun 1,5 x 106 cellen in 15 ml van het sarcosphere groeimedium om de celverdunning van 1 x 105 cellen/ml te maken. Verdun de cellen met een nieuw sarcosphere groeimedium op een seriële wijze om 15 mL van elke celverdunning van 104, 103en 102 cellen/ml te maken. Bereid vervolgens 4 96-goed Ultra-Low bijlage celcultuurplaten, elk voor een celverdunning. Breng 100 μL celsuspensie over van de 105 cellen/ml verdunning naar elke put van de eerste 96-goed Ultra-Low bijlage celkweek plaat. Dit bord heeft 104 cellen in elk goed. Gebruik de andere 3 96-well Ultra-Low bijlage celcultuurplaten voor de andere drie celverdunningen: 104, 103en 102 cellen/ml. Breng 100 μL celsuspensie over naar elke put van de 96-well Ultra-Low bijlage celcultuurplaten. Deze drie cultuur platen hebben 1.000 cellen/goed, 100 cellen/goed, en 10 cellen/goed, respectievelijk. Plaats de platen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 celkweek. Voeg elke drie dagen nieuwe bFGF en EGF direct toe aan het celkweekmedium (eindconcentratie van 20 ng/mL) zonder het medium te veranderen om cellen die verloren gaan in de suspensie cultuur te vermijden. Gebruik een lichte Microscoop om de sarcosphere formatie elke dag gedurende drie weken te monitoren, zoals weergegeven in Figuur 2a. Tel na drie weken het aantal sarcosphere-positieve putten en sarcosphere-negatieve putten van elke celverdunning voor zowel HLA-1-negatieve als HLA-1-positieve cellen. Bereken de frequentie van de Sphere-vormende cellen op basis van een Poisson-kansverdeling13. Vergelijk de HLA-1-Negative TICs met de HLA-1-positieve bulk cellen. Seriële-verdunning tumor-formatie assay Tel de HLA-1-negatieve en-positieve subpopulaties uit stap 2,9. Maak seriële verdunningen van de cellen met PBS naar concentraties van 106, 105, 104en 103 cellen/ml. Gebruik 1 mL van elke verdunning voor de tumorvorming in 10 muizen. Voeg 1 mL kelder membraan matrix toe aan de 1 mL celsuspensie van elke verdunning (1:1). Houd de 2 mL van elk mengsel op ijs. Injecteer subcutaan 200 μL van de cel: basaal membraan matrix mengsel in de flanken van NGS-muizen, met HLA-1-negatieve cellen voor één flank en HLA-1-positieve cellen voor de andere flank van dezelfde muis. Gebruik voor elke verdunning 10 muizen. Gebruik 25G spuiten met een naald voor de injecties. Monitor de tumorvorming in de muizen voor vier tot acht weken, afhankelijk van het tempo van de tumorgroei. Bereken de tumor-initiëren celfrequentie door het percentage van tumorvorming op verschillende invoercel nummers. Vergelijk de HLA-1-Negative TICs met de HLA-1-positieve bulk cellen. Geïnduceerde differentiatie langs mesenchymale trajecten Gebruik de sarcospheres gevormd tijdens de vorige stappen (stap 3.1.9). Breng de sarcospheres over naar een nieuwe 6-put plaat. Cultuur de sarcosphere met 2,5 mL Alfa-MEM aangevuld met 10% FBS om de cellen aan het oppervlak van de kweek plaat te laten hechten. Na een bevestiging voor twee dagen, schakel het kweekmedium van alpha-MEM aangevuld met 10% FBS aan de 1:1 mengsel van Alfa-MEM aangevuld met 10% FBS en Human mesenchymale stamcel (hMSC) groeimedium. Na twee dagen, overschakelen naar voltooien hMSC groeimedium. Wanneer de cellen 90% confluency bereiken, aspireren het hMSC-medium en voeg differentiatie medium toe. Voor osteogene differentiatie, voeg osteogenic differentiatie medium toe (hMSC-groeimedium aangevuld met 10 nM dexamethason, 5 mM β-glycerofosfaat, 50 μg/mL L-ascorbinezuur en 10 mM lithiumchloride). Voor lipogenic differentiatie, voeg adipocyte differentiatie medium (hMSC groeimedium aangevuld met 0,5 μM dexamethason, 0,5 μM isobutylmethylxanthine, en 50 μM indomethacine). Verander het differentiatie medium elke drie dagen. Na drie tot vier weken, stop de differentiatie en was de cellen met PBS. Aspiraat vervolgens de PBS en voeg 2 ml 10% formaline toe aan de cellen voor fixatie. Laat de cellen 45 min bij kamertemperatuur zitten. Was ze met gedeïoniseerd water. De cellen zijn nu klaar voor Alizarin Red S kleuring (stap 3.3.6.1) of olie rode O-kleuring (stap 3.3.6.2). Om osteogenic differentiatie te detecteren, moet u Alizarin Red S kleuring uitvoeren. Zuig water en voeg 2 mL Alizarin Red S werkoplossing (2% Alizarin Red S, pH 6,0) toe aan de cellen en laat ze 5 minuten zitten voor vlekken. Was de cellen met gedeïoniseerd water en observeer de reactie microscopisch. Om adipogene differentiatie te detecteren, voert u olie rode O-kleuring uit. Maak een olie rode O-oplossing. Bereid een stamoplossing door 300 mg olie rood O poeder toe te voegen aan 100 mL isopropanol. Meng binnen 2 uur voor gebruik drie delen (30 mL) olie rode O-stamoplossing met twee delen (20 mL) gedeïoniseerd water. Laat het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur zitten. Filter de werkoplossing met behulp van voor gebruik. Verwijder het water uit de cellen bereid volgens stap 3.3.6. Voeg 2 mL 60% isopropanol toe om de celmonolaag te bedekken en de cellen zitten 2 min. Verwijder het isopropanol en voeg 2 mL olie rode O-werkoplossing toe. Laat de cellen 5 minuten op kamertemperatuur zitten. Spoel de cellen met gedeïoniseerd water en observeer de reactie onder een lichte Microscoop.