Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

Todos os protocolos para experimentos de mouse discutidos aqui foram de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de ética em pesquisa humana do Mount Sinai Medical Center e pelo Comitê de cuidados e uso de animais. 1. processamento da amostra de tecido do sarcoma, e formação de PDX um protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional, o pessoal do serviço de patologia prepara amostras de sarcoma de espécimes cirúrgicos e imediatamente coloca cada amostra no gelo em um prato de Petri de 100 mm. Coloque a amostra em um tubo cônico de poliestireno de 15 mL com 6 mL de meio de cultura de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) frio 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina. Processe a amostra de tecido imediatamente. Opcional Para o osteosarcoma somente, siga as seguintes etapas, que podem ser ignoradas para o sarcoma macio do tecido. Corte o tecido em 20 mm3 peças usando um bisturi. Transfira as peças do tecido para um tubo de 15 mL contendo 3 mL de solução de colagenase (RPMI 1640 com 1 mg/mL de colagenase). Colocar o tubo num banho de água a 37 ° c durante 30 min. Completamente Vortex o tubo e, em seguida, adicionar 3 ml de RPMI 1640 suplementado com 10% FBS para neutralizar a atividade de colagenase. Centrifugar durante 5 min a 350 x g à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante. Trabalhando em um gabinete de biossegurança estéril, coloque a amostra de tecido em um prato de Petri de 100 mm. Adicionar 500 μL de soro fisiológico 1 tampão fosfato estéril (PBS) ao tecido. Com um bisturi estéril, triturar mecanicamente o tecido em partes pequenas até que nenhuma parte visível do tecido seja maior de 0,1 milímetros. Transfira a suspensão da célula 500 μL para um filtro de células de 35 μm e colete a suspensão filtrada com um tubo de poliestireno de 50 mL. Põr este tubo do poliestireno de 50 mL com a suspensão da pilha no gelo. Adicione outro 500 μL de PBS ao tecido. Triturar pela segunda vez, transferir a suspensão através do filtro de células, e recolhê-lo no mesmo tubo de 50 mL. Repita estas etapas (etapas 1.5 – 1.6) até que a seção do tecido esteja dissociada completamente, geralmente 6x-8x. Pellet a suspensão celular por centrifugação em 350 x g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante, Ressuspender o pellet usando 5 mL de tampão de hemólise (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3e 0,1 mm EDTA), e incubar a solução por 5 min à temperatura ambiente para remover glóbulos vermelhos. Centrifugue por 5 min a 350 x g à temperatura ambiente e retire o tampão de hemólise. Lave o pellet com 5 mL de PBS. Centrifugue novamente por 5 min a 350 x g e retire o sobrenadante. Suspender a pelota com 1 mL de PBS e contar o número de células viáveis usando um hemociômetro ou qualquer outro método alternativo. Diluir as células para uma concentração final de 1 x 107 células em 200 ΜL de PBS. Deixe a suspensão celular no gelo. Deixe a matriz da membrana do porão no gelo para permitir que derrete. Adicionar 200 μL de matriz de membrana basal à suspensão da célula 200 μL. Misture suavemente e manter no gelo. Injete subcutaneously a suspensão da pilha: mistura da matriz da membrana do porão (1:1) em dois ratos da gama do scid do NOD (NSG) em seus flancos. Use 200 μL para cada injeção. Monitore a formação PDX verificando o local de injeção dos ratos 2x por semana. Remova o xenograft do tumor quando alcanga 1 cm no diâmetro. 2. isolamento do tumor-iniciando células por FACS a partir do PDX Remova cirùrgica o PDX dos ratos como descrito previamente12. Corte o tumor ao meio. Fixe a metade do xenograft com o paraformaldeído de 4% durante a noite. Isto é para análise histológica. Processe a outra metade do tecido como descrito acima (etapas 1,3 – 1,8) para obter uma suspensão de células tumorais. Ressuspender o pellet com PBS e contar o número de células viáveis. Diluir a suspensão celular em PBS suplementado com 5% FBS para uma concentração de 2 x 106 células/ml. Deixe a suspensão celular no gelo por 30 min. divida a suspensão da célula em dois tubos. Marque os tubos com controle isotópico e anticorpo, respectivamente. Anote o número de células em cada tubo. Prepare 2x anticorpo HLA-1-PE diluindo o anticorpo com PBS suplementado com 5% FBS (1:250). Diluir o anticorpo de controle isotipo negativo com a mesma condição. Misture a suspensão celular do tubo de “anticorpo” com anticorpo diluído (1:1) para fazer a diluição final do anticorpo 1:500. Misture a suspensão celular do tubo “controle isotópico” com controle isotópico (1:1). Coloque as suspensões celulares no gelo por 90 min. Centrifugador por 5 min a 350 x g a 4 ° c e retire o sobrenadante. Adicionar 10 mL de PBS para lavar o pellet 2x. Adicionar 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a PBS a uma concentração final de 10 μg/mL. Adicione esta solução DAPI ao pellet de célula para fazer uma suspensão de célula de 107 células/ml (usando os números de célula da etapa 2,4). Filtre a suspensão celular através de tampas de filtro de 35 μm em tubos de poliestireno de 12 mm x 75 mm. Use um citometro de fluxo para ordenar a subpopulação TIC HLA-1-Negative6. Pilhas viáveis da porta (DAPI-negative) e coletam subpopulações HLA-1-Negative e-positivas em 2 15 tubos da coleção do mL, cada um que contem 4 mL do meio de cultura de RPMI 1640. 3. caracterização de células iniciantes tumorais Formação de sarcosphere Faça meio de crescimento sarcosphere, usando o meio de cultura de células Alpha-MEM. Adicione suplementos para fazer uma concentração final de B-27 suplementos (1x), N2 suplementos (1x), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) (20 ng/mL), e fator de crescimento epidérmico (EGF) (20 ng/mL) e penicilina/estreptomicina (100 UI/mL). Filtre o meio com um filtro de cultura de células de 0,2 μm antes de usar. Pellet a subpopulação classificada HLA-1-negativa e positiva da etapa 2,9 e contar os números de células de cada subpopulação. Diluir 1,5 x 106 células em 15 ml do meio de crescimento sarcosphere para fazer a diluição da célula de 1 x 105 células/ml. Diluir serialmente as células com meio de crescimento da sarcofera fresca para fazer 15 mL de cada diluição celular de 104, 103e 102 células/ml. Em seguida, prepare 4 96-bem ultra-baixa placas de cultura de células de fixação, cada uma para uma diluição celular. Transferir 100 μL de suspensão celular da diluição de 105 células/ml para cada poço da primeira placa de cultura de células de fixação ultra-baixa de 96 poços. Esta placa tem 104 células em cada poço. Use as outras placas de cultura de células de fixação Ultrabaixa 3 96-bem para as outras três diluições de células: 104, 103e 102 células/ml. Transfira 100 μL de suspensão celular para cada poço das placas de cultura de células de fixação Ultrabaixa 96-bem. Estas três placas da cultura têm 1.000 pilhas/poço, 100 pilhas/poço, e 10 pilhas/poço, respectivamente. Põr as placas em um ° c 37, incubadora da cultura da pilha de 5% CO2 . Adicionar novos bFGF e EGF diretamente para o meio de cultura celular (concentração final de 20 ng/mL) a cada três dias sem alterar o meio para evitar células perdidas na cultura de suspensão. Usando um microscópio de luz, monitore a formação da sarcofera todos os dias durante três semanas, como mostrado na Figura 2a. Após três semanas, conte o número de poços sarcosphere-positivos e de poços sarcosphere-negativos de cada diluição da pilha para pilhas de HLA-1-Negative e de HLA-1-positive. Calcule a frequência da célula formando uma esfera com base em uma distribuição de probabilidade de Poisson13. Compare os tiques HLA-1-negativos com as células a granel HLA-1-positive. Ensaio de formação de tumores de diluição serial Conte as subpopulações HLA-1-Negative e-positive da etapa 2,9. Faça diluições seriais das pilhas com PBS às concentrações de 106, 105, 104, e 103 Cells/ml. Use 1 mL de cada diluição para a formação do tumor em 10 ratos. Adicione 1 mL de matriz de membrana basal à suspensão da célula de 1 mL de cada diluição (1:1). Mantenha os 2 mL de cada mistura no gelo. Injete subcutaneously 200 μL da pilha: mistura da matriz da membrana do porão nos flancos de ratos de NGS, usando pilhas HLA-1-negative para um flanco e pilhas de HLA-1-positive para o outro flanco do mesmo rato. Para cada diluição, use 10 camundongos. Use seringas de 25G com uma agulha para as injeções. Monitore a formação tumoral nos camundongos por quatro a oito semanas, dependendo da taxa de crescimento tumoral. Calcule a freqüência tumoral-iniciando da pilha pela porcentagem da formação do tumor em números de pilha diferentes da entrada. Compare os tiques HLA-1-negativos com as células a granel HLA-1-positive. Diferenciação induzida ao longo das vias mesenquimais Use os sarcospheres formados durante as etapas anteriores (etapa 3.1.9). Transfira os sarcospheres para uma nova placa de 6 poços. Cultura a sarcosphere com 2,5 mL de alfa-MEM suplementado com 10% FBS para deixar as pilhas anexar à superfície da placa da cultura. Após um acessório por dois dias, mude o meio de cultura de Alpha-mem suplementado com 10% FBS à mistura 1:1 de alfa-mem suplementado com o meio de crescimento de 10% FBS e da pilha de haste mesenquimais humana (hmsc). Após dois dias, mude para o meio de crescimento hMSC completo. Quando as células atingem 90% de confluência, aspiram o meio hMSC e adicionam meio de diferenciação. Para diferenciação osteogênica, adicionar meio de diferenciação osteogênica (meio de crescimento hMSC suplementado com 10 nM dexametasona, 5 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL de ácido L-ascórbico e 10 mM de cloreto de lítio). Para a diferenciação lipogênica, adicionar meio de diferenciação de adipócitos (meio de crescimento hMSC suplementado com 0,5 μM dexametasona, 0,5 μM isobutylmethylxanthine, e 50 μM indometacina). Mude o meio de diferenciação a cada três dias. Após três a quatro semanas, pare a diferenciação e lave as pilhas com PBS. Em seguida, aspirar a PBS e adicionar 2 mL de formalina a 10% para as células para fixação. Deixe as pilhas sentar-se para 45 minutos na temperatura ambiente. Lave-os com água desionizada. As células estão agora prontas para a coloração de alizarin Red S (Step 3.3.6.1) ou coloração de óleo vermelho O (passo 3.3.6.2). Para detectar a diferenciação osteogênica, realize coloração de alizarin Red S. Aspirar a água e adicionar 2 mL de solução de trabalho de alizarin Red S (2% alizarin Red S, pH 6,0) para as células, e deixá-los sentar-se por 5 min para a coloração. Lave as células com água deionizada e observe a reação microscopicamente. Para detectar a diferenciação adipogênica, realize a coloração de óleo vermelho O. Faça uma solução Oil Red O. Prepare uma solução de ações adicionando 300 mg de óleo vermelho O pó a 100 mL de isopropanol. Dentro de 2 h antes de usar, misture três partes (30 ml) da solução do estoque do óleo vermelho O com duas porções (20 ml) da água deionizada. Deixe a mistura sentar-se durante 10 min à temperatura ambiente. Filtre a solução de trabalho usando antes de usar. Retire a água das células preparadas de acordo com a etapa 3.3.6. Adicione 2 mL de isopropanol a 60% para cobrir a monocamada celular e as células se sentam por 2 min. Retire o isopropanol e adicione 2 mL de óleo vermelho O solução de trabalho. Permita que as células se sentem por 5 min à temperatura ambiente. Enxague as células com água deionizada e observe a reação um microscópio de luz.